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标题:甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

去看海[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好：
想请教一下，哪一位学者做过定量pcr呀？想问一下都买哪个厂家什么么型号的试剂盒啊？谢谢
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过路甲[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢春雨濛濛，按照你提供的protocol，我的COBRA终于也成功了，几个月了，第一次在PCR后看到了目的条带，真是欣喜若狂，本来已经快绝望的实验终于也看到了光明的前途。个人的经验认为在甲基化的实验中，PH值一定要准确，这也关系着处理后能够回收的DNA的量。其实DNA量还是1～2ug比较适宜，多了可能处理不完全。双蒸水本身PH值也要注意一下，原来我配制试剂用的双蒸水都是自己实验室蒸馏的，最近蒸馏器坏了，换了设备科领的双蒸水，而自从换了后实验就成功了，实验中的其他条件及试剂均没有变换过。
个人的经验亚硫酸氢钠还是比较好溶的，而且一般溶的比较快的，也不需要用NaOH调节PH值。
总之，再次衷心地感谢春雨濛濛。
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嗨皮[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下，我也要做dna甲基化，我想问一下再dna地区的过程中必须进行RNA酶的处理吗？如果不处理的话会导致什么样的后果？  
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嗨皮[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下。要配制3M亚硫酸氢钠怎么配制阿？上面只描述的3.6M的亚硫酸氢钠，谢谢！
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finger[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下，我也要做dna甲基化，我想问一下再dna地区的过程中必须进行RNA酶的处理吗？如果不处理的话会导致什么样的后果？


不知道你问的时RNA还时RNA酶？

就我所知道的，DNA提取过程中必须加RNase对RNA进行处理。因为MSP的原理是：该法用 HSO3-处理单链DNA，使所有未甲基化的C脱氨转变为U,而甲基化的C则保持不变。然后经特异性扩增放大，测序。C位点就是甲基化位点，C的量即甲基化量。而且甲基化都是对DNA的其中的一条链进行扩增，那么有RNA的话就会对反应有影响。

看有的战友问纯化用的什么试剂盒，我们实验室用的是 QIAGEN DNeasy Tissue Kit 编号 69504 50个反应的，除了有一点改动外，基本就是按上面纯化的步骤俩遍(是我们老板在国外就这么用的）。

我们实验室配的是4.8M 的 sodium bifufite 配方：9.1g sodium bisulfite 19ml H2O 950ul 5N NaOH (adjust pH to 5.0)
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@木木@[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
甲基化MSP后再半巢式PCR对启动子区进行扩增，最后测序，可否。
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loli[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有用过chemicon公司的CpGenome modification kit试剂盒的战友啊，我用了快两个月了还没出结果，有这方面经验的战友给点建议吧。
DNA没问题，都说做的时候要轻柔，但不知道要怎么轻阿，酒精洗的时候白色沉淀用不用打碎？？？？还是只轻轻弹起就行？pH只是不是要求很严格阿，包括亚硫酸氢纳和洗脱用的TE液.还有那些非常敏感要严格注意注意的地方。请战友们帮兄弟分析分析阿！
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发表于 2011-8-31 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有用过chemicon公司的CpGenome modification kit试剂盒的战友啊，我用了快两个月了还没出结果，有这方面经验的战友给点建议吧。
DNA没问题，都说做的时候要轻柔，但不知道要怎么轻阿，酒精洗的时候白色沉淀用不用打碎？？？？还是只轻轻弹起就行？pH只是不是要求很严格阿，包括亚硫酸氢纳和洗脱用的TE液.还有那些非常敏感要严格注意注意的地方。请战友们帮兄弟分析分析阿！
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小鼹鼠[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好：
再请教一下，在进行DNA提取过程中如果加入RNase对RNA进行处理，大多数都要求RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。我想请教一下，所谓的进行再处理具体指什么？怎么样才能判定RNA酶中不含有DNA酶？
还有想请问一下淡泊以明志 宁静而致远 ，你们做的是荧光定量pcr吗？ 你们用的QIAGEN DNeasy Tissue Kit 的试剂盒，效果如何？我要做荧光定量pcr是不是也可以选用呢？谢谢！
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finger[使用道具]
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发表于 2011-8-31 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好：
再请教一下，在进行DNA提取过程中如果加入RNase对RNA进行处理，大多数都要求RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。我想请教一下，所谓的进行再处理具体指什么？怎么样才能判定RNA酶中不含有DNA酶？
还有想请问一下，你们做的是荧光定量pcr吗？ 你们用的QIAGEN DNeasy Tissue Kit 的试剂盒，效果如何？我要做荧光定量pcr是不是也可以选用呢？谢谢！

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你好：
首先回答你的问题，我在做细胞DNA的甲基化修饰时，买的就是公司里没有DNA酶的那种RNase，生工BBI的，没有做什么后处理。

我们当然也做荧光定量PCR，是加TRIZO后送给公司做的。细胞我是拿QIAGEN的试剂盒抽提和纯化的。效果还行，能保证修饰后DNA丢失不多，我都能做出来，主要是你修饰一定要完全，如果修饰不完全，你第一轮的模板可以加到4ul（50ul体系），也能做出来，只不过重复性不好。
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