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标题:甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-9-1 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
总算找到甲基化组织了，不容易。
这里我有些问题想请教各位战友，特别是春雨楼主。

我的情况很许多人一样。做的是kit提组织DNA，zymo的甲基化修饰试剂盒，一般的Taq酶跑巢式MSP。引物依据文献。
原先用两个样本摸条件，目的条带也都出来了。以为条件已经成熟，上了大批量，结果pcr第一轮什么都没有了。

之后DNA重新提过，修饰过，酶，等PCR材料都换过了条件也没变，还是老样子。
很苦恼一直找不到原因。请大侠帮忙分析一下，明天打算轻柔的再仔细试一下。

甲基化修饰后的DNA，－20℃保存时间有多长？所说单链不稳定，容易降解，我想－20℃应该还可以吧，4℃是一个礼拜就降解没了的，吃过苦头了。
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冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-9-1 09:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
总算找到甲基化组织了，不容易。
这里我有些问题想请教各位战友，特别是春雨楼主。

我的情况很许多人一样。做的是kit提组织DNA，zymo的甲基化修饰试剂盒，一般的Taq酶跑巢式MSP。引物依据文献。
原先用两个样本摸条件，目的条带也都出来了。以为条件已经成熟，上了大批量，结果pcr第一轮什么都没有了。

之后DNA重新提过，修饰过，酶，等PCR材料都换过了条件也没变，还是老样子。
很苦恼一直找不到原因。请大侠帮忙分析一下，明天打算轻柔的再仔细试一下。

甲基化修饰后的DNA，－20℃保存时间有多长？所说单链不稳定，容易降解，我想－20℃应该还可以吧，4℃是一个礼拜就降解没了的，吃过苦头了。
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发表于 2011-9-1 09:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 跳跳糖 于 2011-9-1 09:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上的，我们研究甲基化，主要是看这种表观遗传现象对基因有什么影响，一般研究启动子区，可以看甲基化后，基因的mRNA有上调还是下降，在和样本的信息联系，看这种上调或下降对某基因的表达有什么影响，当然mRNA的表达有的时候和蛋白 ...


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发表于 2011-9-1 09:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
NaHSO3和对苯二酚的具体配制过程能讲一下吗？我从好多文献上看过其配制都觉得很麻烦，觉得您的配置方法好像不错，想请教一下您的具体方法，谢谢。
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发表于 2011-9-1 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好
想请教一下各位，甲基化特异性的引物序列，文献上都只有其具体的序列，但是有一个问题我一直不明白，究竟哪个位点进行了甲基化修饰，有文献上说是在5‘端，可是序列上并没有标明哪一碱基进行了甲基化，进行序列合成时也只是按照文献上说的序列进行合成，也没有标明具体对哪一个碱基进行修饰而为什么就认为那样的序列就是甲基化特异性的呢？问题可能有点幼稚，但真的很想知道。敬请各位指点迷津， 谢谢
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发表于 2011-9-1 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教各位
我刚接触试验,问一个弱的问题,就是DNA提取后,跑了电泳,下一步取2ug进行试验,这个2ug是怎么定量的呀?
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-1 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
先用紫外分光光度计测量你的基因组模版浓度，得出个数值，在按你的数值加××ul 就可以了。如模版浓度500ng/ul，那么你就加4ul模版，在加46ul ddH2O就可以（这里我们实验室是按50ul做的）
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发表于 2011-9-1 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 葡萄籽 于 2011-9-1 09:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大家好
想请教一下各位，甲基化特异性的引物序列，文献上都只有其具体的序列，但是有一个问题我一直不明白，究竟哪个位点进行了甲基化修饰，有文献上说是在5‘端，可是序列上并没有标明哪一碱基进行了甲基化，进行序列合成时也只是 ...

甲基化是胞嘧啶的5‘端发生甲基化。甲基化引物序列是根据你模版修饰改变后设计的，如果你没修饰前的引物结合区假设是：AGCG****，那么修饰后还是AGCG****,如果是AACG****，那么修饰后就变成AAUG****，这样的话你的甲级化引物要和其想对应。非甲级化引物就不考虑上述变化。
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发表于 2011-9-1 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好!
再次提问:基因启动子区域若无CpG岛是否没必要做MSP?
换做MS-SSCA法行吗?
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-1 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的~
首先你要明确MS-SSCA原理：甲基化敏感性单链构象分析（MS-SSCA）又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）（BiPS），由Maekawa等1999年报道。方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确。

这种方法的优点是：1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析；2.能够对甲基化的等位基因进行半定量；3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性；缺点是：1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低；2.检测片段不宜过长。

也是基于对CpG岛的甲基化研究！不管哪种甲基化研究方法，如果你要研究的区域没有CpG岛，都是没有意义的。但可以研究该启动子区域，单核苷酸多态对启动子的影响！
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