甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） - 经验共享

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标题:甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

dreaming[使用道具]
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151

发表于 2011-9-1 10:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外,2006年底nature上一篇文献提到:非CpG岛序列的甲基化状态发生改变也可以影响基因表达.正是基于此,导师坚持要继续做甲基化,苦于目前研究的方法都涉及CpG岛,实验毫无进展.请问liuzeyi2002,有没有具体方法可行呀?

学习了，能否把你的这篇文章发给我！因我们实验室主要研究是肿瘤遗传易感性的，主要是甲基化和SNP。还真不知道非CpG岛序列的甲基化的研究方法！
这篇文献的相关线索是：Brena RM， Huang THM，Plass C Toward ahuman epigeneme Nature Genetics 2006，38（12）：1359-1360
抱歉！导师给的是纸质版材料。若你有兴趣，可上网查查看。敬待交流指导！

花裙子[使用道具]
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152

发表于 2011-9-1 10:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好。我刚接触这方面的东西，很多问题都不了解。请教各位：用福尔马林泡过的肺癌组织还可以用来做MSP么？DNA提取方法与新鲜的组织有何不同么？还有各位前辈能否上传一份MSP所需试剂清单？多谢啦！

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我正好做过这方面的实验，不过结果并不太好，这要还是提取DNA那一步，消化比较困难，我曾经有过把解剖教研室拿来的肝组织加强消化液和蛋白酶K两周没有消化掉的记录，呵呵，想起来都有意思。
从亚硫酸盐修饰DNA测定甲基化的原理上来说，我认为福尔马林浸泡的组织也好，其他什么处理的组织也好，都不会影响检测，因为修饰前的强碱变型的那一步对DNA的打断和变性都应该比这些处理的过程对DNA损伤严重，这点你可以从仔细阅读发展这个方法的早期文献得到。所以，原则上，你只要提出DNA，哪怕质量差点，MSP是能做的。当然，我说的是一个理论问题，实际操作要困难些，比如我上面说到的我的经历。

过路甲[使用道具]
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153

发表于 2011-9-1 10:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dreaming 于 2011-9-1 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
另外,2006年底nature上一篇文献提到:非CpG岛序列的甲基化状态发生改变也可以影响基因表达.正是基于此,导师坚持要继续做甲基化,苦于目前研究的方法都涉及CpG岛,实验毫无进展.请问liuzeyi2002,有没有具体方法可行呀?

...

一直在做BSP和MSP，对基因组整体甲基化的研究向来望而却步，但是，据我所知这方面文章是不少的，特别你去看看甲基化检测方法学方面的综述，很多要提到这点，我记得的方法包括：酶切、DHPLC、MS等等，应该不难找。不过抱歉我就不能直接找来给你了。

绵绵[使用道具]
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154

发表于 2011-9-1 10:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主我的水对照的U那管总出现两条带，与阴性对照的那管区分不开，请问这是怎么回事，谢谢！

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-1 10:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上：
我来回答你这个问题吧，你这不是甲基化检测的问题，是PCR污染的问题。正好做过PCR污染方面的培训，所以回答一下，希望对你有帮助。
这种情况就是PCR污染了，英文多数时候称为‘carry-over contamination '。一般来说PCR污染分为三种情况：样本间交叉污染(inter-sample contamination)；质粒污染（cloned vector contamination)和PCR扩增产物污染（PCR amplicons contamination, amplicon carryover）。通常情况你比较容易排除前两种可能，PCR产物污染最为常见。出现污染最可能的原因有哪些呢？一般情况下有：操作错误或者误差造成的样品间交差污染；PCR试剂的污染；PCR实验器材的污染；
气溶胶（Amplicon Aerosol）。那你看看你是那种情况，再对症下药。如果你只是想快点解决问题，不想过多追究原因，也有一个比较简单的办法，那就是：1）换试剂，把你所有PCR的试剂都换掉；2）换地方和器材。
最后说一句，PCR污染是个大问题，我个人甚至认为没遇到过PCR污染，你不能说懂得PCR。

细水长流[使用道具]
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发表于 2011-9-1 10:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，我也在做dna甲基化方面的课题，在对基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰的过程中，大家都一致提到调节pH的重要性，我在做试验的过程中用PH计检测PH值，用氢氧化钠来调节PH值，但是每次调节都在4.99－5.05之间，很少有刚好为5.0的时候，我想知道这样对修饰有没有影响？还有一个问题就是，我们做修饰时要用3M的亚硫酸氢钠，这个单纯配制时比较容易，但是配制好的溶液在用氢氧化钠调节PH值时他的物质的量浓度好像也会发生改变吧？有人告诉我，开始配制时水量可以适量少一点，调好pH值后再定容，但是这样的话pH值会发生改变吗？并且配制好，调节好PH值的溶液加到50ul的dna溶液中后，其PH值好像也不是5.0了吧，不知道我们需要的是单纯PH值为5.0的亚硫酸氢钠，还是要求整个修饰反应体系的PH值为5.0，一直搞不懂这几个问题，自己修饰出来的dna也扩增不出东西来，不知道什么原因，很着急，麻烦各位高手指点一下迷津，非常非常感谢！！！！！

许愿精灵[使用道具]
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发表于 2011-9-1 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

希望大家多多发言交流！

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王六六[使用道具]
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发表于 2011-9-1 10:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教大家,我提取好的DNA测浓度,稀释后测定,与放置时间有关吗,我怎么稀释好的DNA放置时间越长,测得的浓度越高呀?测定了三次,一次比一次高?

还有我修饰后DNA测浓度,应该安单链DNA还是双链DNA算呀?

请大家多多指导