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标题:甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

细水长流[使用道具]
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发表于 2011-8-31 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主你好.谢谢你的帖子,给大家的实验帮助很大.我现在发现在甲基化扩增时,会出现假阳性的情况,该怎样解决呢?
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嗡嗡[使用道具]
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发表于 2011-8-31 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主对DNA处理完全的概率有多大把握？
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finger[使用道具]
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发表于 2011-8-31 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 嗡嗡 于 2011-8-31 15:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主对DNA处理完全的概率有多大把握？

回答：完全按照上述步骤进行的话，修饰时间达16小时，我认为处理完全的概率可在90%以上。仅仅是经验，没有数据支持。
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+田田+[使用道具]
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发表于 2011-8-31 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问楼主：我以前做出来过，现在用同样的标本，同样的试剂和退火温度做不出来了，怎么回事啊？现在把退火温度降了六度，还是偶尔能跑出来，引物是参考文献上的，修饰使用的QIAGEN的试剂盒，酶是Takara 的普通Taq酶，因为扩增的片断很短，不知道是哪一步出了问题，到现在都做不出来。请多指教！
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发表于 2011-8-31 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 finger 于 2011-8-31 15:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基 ...

谢谢楼主的protocol,我是初学者,刚接触这部分实验.我在文献上查到了一对引物，但是PCR结果不论是正常组织还是癌组织M带都是阳性,偶尔U区有阳性带,我怀疑是U 引物的问题,现在想验证一下这对引物,但是不知道怎么和Genebank比对,请楼主指教,谢谢!
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finger[使用道具]
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发表于 2011-8-31 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #11 细水长流 的帖子

回答：做阴性对照~~~~~~~
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发表于 2011-8-31 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你好！我现在也准备做这方面试验，有个弱问题：U引物和M引物是分开P还是同一管P？先谢谢你了
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发表于 2011-8-31 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 +田田+ 于 2011-8-31 15:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主：我以前做出来过，现在用同样的标本，同样的试剂和退火温度做不出来了，怎么回事啊？现在把退火温度降了六度，还是偶尔能跑出来，引物是参考文献上的，修饰使用的QIAGEN的试剂盒，酶是Takara 的普通Taq酶，因为扩增的片断很短，不 ...

回答：如果曾经做出来过，提示引物没有问题。由于甲基化的步骤比较多，涉及的因素也会比较多。
首先，您指的“同样的标本”是指未修饰的基因组DNA么？如果是，必然还要进行修饰。我觉得修饰前可以将DNA跑个电泳，重新估计一下修饰的量。
其次，使用试剂盒修饰应该是没有问题，完全按照步骤操作应该结果是稳定的，并且曾经有过结果，表明修饰一定是成功的。在这里比较重要的就是修饰的DNA的量了。我认为还是“宁多勿少”，因为不管紫外方法也好、电泳估量也好，都不是十分精确，尤其前者，有时结果会偏高，按此计算的话，实际进入修饰的DNA可以说微乎其微。我也曾用过试剂盒，不管什么试剂盒都会有纯化回收的步骤，只是方法可能有差别，但只要有这一步必然伴随着或多或少DNA的丢失，因此，如果初始DNA量就少，加上损失的，最后根本没有多少模版可供进一步实验了。
3：再有就是在PCR体系上。必要保证每种成分量的准确性。有书上说，新手之所以不能重复结果，很大一部分原因是由于加样的问题。所以我觉得在配制PCR体系上要保证几ul就是几ul，量要准确。
综上，我感觉主要还在修饰这一步上。
1：基因组DNA量大一些。
2：严格按照操作手册修饰。
3：配制PCR体系时保证各种成分的准确。
再试试，应该没问题的。
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发表于 2011-8-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 年轮 于 2011-8-31 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，你好！我现在也准备做这方面试验，有个弱问题：U引物和M引物是分开P还是同一管P？先谢谢你了

回答：分开做好些。我看的文献都是分开的。
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发表于 2011-8-31 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 年轮 于 2011-8-31 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，你好！我现在也准备做这方面试验，有个弱问题：U引物和M引物是分开P还是同一管P？先谢谢你了

回答：分开做好些。我看的文献都是分开的。
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