甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） - 经验共享

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

422 3/43 ‹‹1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

finger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 71816
精华 0
积分 574
帖子 787
信誉分 100
可用分 4799
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态离线

发表于 2011-8-31 15:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由小葵于 2011-8-31 15:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢楼主的protocol,我是初学者,刚接触这部分实验.我在文献上查到了一对引物，但是PCR结果不论是正常组织还是癌组织M带都是阳性,偶尔U区有阳性带,我怀疑是U 引物的问题,现在想验证一下这对引物,但是不知道怎么和Ge ...

回答：首先要有DNAman这个软件；其次，找到这个基因的Genbank号，一般文献上会提供，在G

finger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 71816
精华 0
积分 574
帖子 787
信誉分 100
可用分 4799
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态离线

发表于 2011-8-31 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果做测序，请继续往下看。
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜。
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。

finger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 71816
精华 0
积分 574
帖子 787
信誉分 100
可用分 4799
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态离线

发表于 2011-8-31 15:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
37度，孵箱过夜。
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

以上是我实验的全部过程，终于写完了和大家分享，希望对大家有帮助。如有疑问，敬请提出，以便交流。并请不吝斧正。

阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态离线

发表于 2011-8-31 15:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了第一、二部分，有个问题提出来与楼主和同道商榷。
“基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug”，楼主的这一句话可有依据？据我的经验正好相反，为了保证修饰的质量DNA一定不能多，道理很简单，资源限定了，有多少的亚硫酸氢盐只能对应相应的DNA，实际上1996年PNAS上的那篇经典文章用到的DNA还只有1微克，即使这样也不能达到去甲基化的C完全转化。我自己曾经BSP测序比较过，超过2微克，修饰的不完全现象就比较明显了。不要被加大起始DNA量出带的假想蒙蔽，带是可以出，但是如果没有高质量修饰的保证，出来的带只能误导自己。要提高灵敏度，可以通过减少修饰过程中的DNA损耗以及加大你上样的模版体积来达到。
另外，对于用来修饰的DNA，其实完整性是不用过多考虑的，因为碱变性的过程除了分开双链，打断DNA链也是强烈的，而且楼主用的42度，30分钟很强的碱变性条件了。
下回再分解。

大猫[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 70000
精华 0
积分 156
帖子 92
信誉分 100
可用分 1161
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态离线

发表于 2011-8-31 15:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主和tibeteagle，MSP和BSP两种方法中，在PCR扩增之前的DNA提取修饰纯化回收的操作是可以通用的吗？谢谢！我是新手，也许问题比较弱智。

finger[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 71816
精华 0
积分 574
帖子 787
信誉分 100
可用分 4799
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态离线

发表于 2011-8-31 15:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 阿拉蕾 于 2011-8-31 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看了第一、二部分，有个问题提出来与楼主和同道商榷。
“基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug”，楼主的这一句话可有依据？据我的经验正好相反，为了保证修饰的质量D ...

感谢您的问题。之所以提到初始dna量的问题，我也是经过考虑的。这是因为目前定量的方法不甚准确。不知您有什么很好的定量方法吗？我曾经比较过紫外分光光度仪测定的量和电泳跑带估计量是有一定差距的。减少修饰过程中dna的损失是很好的建议，但请详细说说如何做到，给大家一个参考。

@花开花落@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71290
精华 1
积分 267
帖子 250
信誉分 102
可用分 1986
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2011-8-31 15:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做修饰的时候碱变性条件为37度10分钟,另外我用的是2M的NaOH做碱变性,而用3M的NaOH调亚硫酸氢钠PH值,这是我查文献看到的,不知道不同浓度的NaOH有什么作用?
还有加糖原助沉时我用2ul,是不是量越大越好呢?
怎么才能减少修饰过程中DNA的损耗呢?

@花开花落@[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 71290
精华 1
积分 267
帖子 250
信誉分 102
可用分 1986
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态离线

发表于 2011-8-31 15:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还有一个问题请教楼主,如何通过电泳跑带估计DNA的浓度呢?

微笑的海豚[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 70439
精华 0
积分 277
帖子 313
信誉分 100
可用分 2266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态离线

发表于 2011-8-31 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主问到怎么解决减少DNA的损失问题，其实这没有更多的东西，关键的是两步，其一是过柱过程，分次冲洗，加温过柱是基本办法；其二是沉淀，尽量用保守的方法，加盐，低温到负80度等都可以做，还有就是沉淀时间，总之，在正常提取DNA中认为是对DNA得率影响不大的步骤现在都要考虑到，毕竟我们的起始量就只有1-2微克。
说到设计引物甚至探针的问题，这才是MSP让人头疼的，先说一句我的体会，你想有点自己的东西，忘掉你记得的常规PCR设计的大多数规则吧，MSP和BSP大多数情况下都不会遵循这些规则。满足一些主要的关键点就是了，比如3‘端互补不能太多，诸如此类的问题，其他你不能要求太多。
而说道PCR，一个字“摸”，以你的设想大胆设计引物，然后摸PCR条件，其实PCR是很人性的，大多数时候他能顺从你的要求。
酶是关键，这点我以前并不感觉，因为我崇尚摸条件，不过最近在铁的事实面前不得不承认，好酶就是有效果，可能是小农意识惯了，呵呵。但是，还是强调，做MSP时候先找主观原因，再找客观的。

胖小妮子[使用道具]
二级
Rank: 2

UID 70442
精华 0
积分 149
帖子 77
信誉分 100
可用分 1061
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态离线

发表于 2011-8-31 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教一下楼主，DNA经亚硫酸盐修饰后，必须得经过纯化回收吗？若纯化，您用的这个试剂盒大约多少钱？什么规格的？

422 3/43 ‹‹1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ›››|