PCR仪

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谢谢楼主的回答

如果目的片段CG含量密集的话，BSP的引物设计就比较困难。有时不得不去扩增大片段，虽然扩增的成功率远不及小片段，但国外也有牛人扩增了1000bp的。

克隆测序虽然能准确分析单一链的甲基化位点，但一般认为要分析10个克隆才能代表样本的甲基化状态，其工作量与费用可想而知。

所以目前做PCR产物直接测序研究的也不少，有关这方面的论文近年也有发表。直接测序虽然比较困难，但一般认为能半定量分析样本的真实甲基化状态，也具有高通量分析的优势。

我也试过直接测序，上游引物及下游引物都试过了，的确困难，难倒测序公司的人了，呵呵。


回答：我想直接测序有一个很大的问题就是扩增序列中TA成分过多，与普通测序不同。就我所知，还是克隆测序更普遍些。费用的确昂贵，如不是非需要测序，MSP是很好的办法。

春雨濛濛老师，您好！
最近在摸甲基化PCR的条件，从49到58，每2°一个梯度，都试过了，只有51度有个很浅的带，不过同样条件，又没有跑出来，我是预变性94度5分钟，变性94度10sec，退火30sec，72度1min，40循环，72度10分钟延伸。看了一篇文献，说变性时间要延长，不知道正确与否？我的实验条件是否存在问题，还望赐教！谢谢！

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回答：首先和你交流一下我的PCR条件：
95ºC，3min（预变性）
94ºC，45sec
52ºC，45sec ×35cycles
72ºC，45sec
72ºC，10min

其次，我感觉曾经出过结果，当时条件应该是可以参考的。请注意所用的试剂是否一致，所加的试剂的量是否准确。我的一个感觉，PCR之所以不能重复，有时候与每次操作时加入体系中的各成分的量不准确有关。因为PCR体系一共才20-25ul，1ul所占比例就很大了，如果每样都多个或少个零点几微升，估计整个体系内的成分比例就改变了。在这方面我有教训，仅供参考。