PCR仪

我买的是chemicon的甲基化修饰试剂盒，3200左右，可以做100份左右的标本。

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效果怎么样呢？

请教楼主和各位高手！！
我做MS-PCR已经四个月了还是没有结果，条件总是摸不好！！
说说我的实验步骤：
1. 我用欧米伽的组织DNA提取试剂盒提取人体新鲜组织标本，测DNA浓度基本都在200-300ng/ul.
2. 应用大约2ug DNA进行亚硫酸盐修饰----这一步直接应用Takara的甲基化检测试剂盒。
3. 按操作说明修饰纯化后的DNA进行PCR,反应体系为：
DNA 4 ul
dH2O X ul
Primer 各0.5 ul, 共1 ul
dNTP mixture (2.5mM each dNTP) 2.0 ul
10 X PCR Buffer 3.0 ul
Taq (5 U/ul) 0.3 ul
总体积 30ul
反应条件为：94度 3min；（94度 30s，51-59度 30s，72度 30s）35个循环；72度 4 min, hold at 4度.
结果试剂盒里所给的阳性对照可以做出来，但就是目的基因出不来，大多数时候都是引物二聚体，少数时候什么都没有。我已经尝试将退火温度一再调整！
自己分析其原因1. 引物浓度过高？？我的引物是按照OD值十倍稀释，从而使引物浓度能够达到10uM,如 1OD=0.0050umol, 加水500ul. 不知道这样合理否？？
2. 引物设计有问题？？我一共设计了8个基因的甲基化引物，都是参照影响因子在5以上的杂志的文章，结果几乎一一尝试了，均得到几乎相同的结果（引物二聚体），不知道这样可否排除引物的问题？？
附上我今天失败的结果，希望大家能够帮忙分析分析，小弟感激不尽，眼瞅着就要毕业，这结果。。。哎！！

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以下是我甲基化的条件（MSP）你可以参照一下！
Final Conc

10×buffer 5 1*
25uM MgCl2 3 (1.5mM)
2.5uM primer F 5 (0.25uM)
2.5uM primer R 5 (0.25uM)
dNTPs 2.5uM 4 4 (200uM)
Taqgold 5U/ul 0.2 (1.0U)
ddH2O 25.8
Modified DNA 2 (0.1ug)
Final Uolume 50

我修饰用的试剂盒，DNA一般浓度控制在500ng,不超过1ug.

引物文献报道的一般是可行的，但也有P出的（酶，模板都是不一样），要自己摸条件。

根据自己的经验做特异性甲基化主要是：

1. 引物一定要正确
2. 模板最好是能用试剂盒修饰
3. PCR酶很重要。

以下是我甲基化的条件（MSP）你可以参照一下！
Final Conc

10×buffer 5 1*
25uM MgCl2 3 (1.5mM)
2.5uM primer F 5 (0.25uM)
2.5uM primer R 5 (0.25uM)
dNTPs 2.5uM 4 4 (200uM)
Taqgold 5U/ul 0.2 (1.0U)
ddH2O 25.8
Modified DNA 2 (0.1ug)
Final Uolume 50

我修饰用的试剂盒，DNA一般浓度控制在500ng,不超过1ug.

引物文献报道的一般是可行的，但也有P出的（酶，模板都是不一样），要自己摸条件。

根据自己的经验做特异性甲基化主要是：

1. 引物一定要正确
2. 模板最好是能用试剂盒修饰
3. PCR酶很重要。

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谢谢斑主啊！！问您一个比较弱的问题，
但是我想知道你的引物是怎么稀释的？？
因为引物说明上只给了1OD=###umol.那应该加多少水稀释才可以达到10uM阿？？----这个我一直搞得有些模糊？？？
多谢不吝赐教！！

谢谢斑主啊！！问您一个比较弱的问题，
但是我想知道你的引物是怎么稀释的？？
因为引物说明上只给了1OD=###umol.那应该加多少水稀释才可以达到10uM阿？？----这个我一直搞得有些模糊？？？
多谢不吝赐教！！


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引物合成后会附带一张说明书，按说明书一般是配成100uM的引物，然后拿部分已经溶解成100uM的引物再稀释10倍就可以了。

回答：就我的经验看，没有问题！主要看您的实验室资金是否充裕，甲基化试剂盒一般在4000元左右，能做20例（2006年的信息，近期有无进展不清楚）。甲基化试剂盒解决的只是DNA修饰和回收的问题，后续的PCR还要自己做。我感觉，使用试剂盒，不用配试剂，步骤上是减少了，您可以尝试。

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谢谢！
我做的是细胞方面的甲基化实验，细胞成分是离心之后的沉渣，请问您提取DNA的细胞量应该是多少呢？

回答：就我的经验看，没有问题！主要看您的实验室资金是否充裕，甲基化试剂盒一般在4000元左右，能做20例（2006年的信息，近期有无进展不清楚）。甲基化试剂盒解决的只是DNA修饰和回收的问题，后续的PCR还要自己做。我感觉，使用试剂盒，不用配试剂，步骤上是减少了，您可以尝试。

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谢谢！
我做的是细胞方面的甲基化实验，细胞成分是离心之后的沉渣，请问您提取DNA的细胞量应该是多少呢？

请问各位大侠，下面是我跑的甲基化-PCR电泳图，这是模板问题还是PCR条件有问题或者是PCR体系污染了，请同行们指点！十分感谢！