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标题:甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

+田田+[使用道具]
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发表于 2011-9-2 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我也是做肿瘤甲基化的，已经半年了，不出结果，郁闷。希望做甲基化的同学能够互相联系，交流下实验情况。
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wawa[使用道具]
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发表于 2011-9-2 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你问的时RNA还时RNA酶？

就我所知道的，DNA提取过程中必须加RNase对RNA进行处理。因为MSP的原理是：该法用 HSO3-处理单链DNA，使所有未甲基化的C脱氨转变为U,而甲基化的C则保持不变。然后经特异性扩增放大，测序。C位点就是甲基化位点，C的量即甲基化量。而且甲基化都是对DNA的其中的一条链进行扩增，那么有RNA的话就会对反应有影响。

我所在的实验室提取DNA从来都不用RNase，这与我在国内不太一样，我问过他们为什么，回答是在提取过程中RNA会自然降解，无需专门特殊处理。我看他们做了这么多MSP结果的确是没有影响。
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旋转木马[使用道具]
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发表于 2011-9-2 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
新手报个到。
刚开始准备做MSP，以后还望各位师兄师姐指教！
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发表于 2011-9-2 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问各位师兄师姐，哪个厂家的甲基化修饰试剂盒比较好？
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发表于 2011-9-2 10:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问各位大侠，下面是我跑的甲基化-PCR电泳图，这是模板问题还是PCR条件有问题或者是PCR体系污染了，请同行们指点！十分感谢！

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设置不加模板的阴性对照吧
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红豆冰[使用道具]
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发表于 2011-9-2 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看了半天甲基化还真是复杂的啊，眼都花了！我也在做细胞株的甲基化实验，也很头大啊!今晚找到这个甲基化的论坛，真好啊！
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发表于 2011-9-2 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教各位大侠：
在DNA提取过程中用的， RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶

现在一般公司买的RNA酶溶液是不含DNA酶的吗？我们现在用的是TIANGEN公司的RNAaseA RT405-02，请问是能直接使用还是需要进行处理？如何处理呢？

我们是用的用试剂盒做的修饰，引物是参考文献的（所见文献用的几乎相同），同一批修饰的模板，两个基因都是有时阳参能P出来，但引物二聚体很多，阴参一个是在引物二聚体的位置成模糊一片，还有一个只有引物二聚体，试跑过温度梯度，也没有很明显的改变，希望各位能指点一下，到底还能怎么做下去
万分万分的感谢！！
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许愿精灵[使用道具]
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发表于 2011-9-2 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
刚要开始做甲基化的实验，很多东西不懂。看来论坛里这类的高手还真是很多啊。先看着多学点！
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-2 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一个新手弱弱的问题
想问一下楼主 MSP 中引物设计这一点 有一个要求就是M 和 U pair 引物中必须要有一样的CG 位点 这是为什么
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羊咩咩[使用道具]
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发表于 2011-9-2 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人认为MSP与位点特异性PCR有异曲同工之处，不过是位点特异性PCR检测的是单个的SNP位点，而MSP检测了多个CpG位点的状况。MSP中M和U有一样的CG位点，主要是为了更为准确地反应一个基因的某一区域的CpG状态究竟如何。两组引物扩增同样的区域，其结果才能更好地反应问题。
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