小中大我也在做甲基化转化方面的实验,楼上的提问DNA经亚硫酸盐修饰后，必须得经过纯化回收吗？如果按照楼主的实验方案,那么就必须要使用纯化试剂盒,具体什么价格和规格,我不是太清楚,我这边实验室是找实验室管理员老师,直接去订的.对于转化的DNA用量,我也觉得不能太大,我个人的看法是用量不能太大,1μg左右,此外,对于亚硫酸盐溶液的配制过程中,关键是要注意避光和低温,亚硫酸氢钠和氢醌的溶解是一个问题,尤其是氢醌,本身微溶于水,所以稍大浓度就不能完全溶解,我的经验是将氢锟溶于提前低温处理的双蒸水中,锡纸包裹后振荡可以加速溶解.对于亚硫酸氢钠的溶解,的确,较大浓度配制时溶解也不容易,加入NaOH可以有助于其溶解,但是个人认为尽量不要使用.对于引物设计的问题,我也一直在寻找,因为我要做的基因比较新,文献上面还没有关于这个基因的MSP或者基因芯片检测甲基化方面的文章,按照我的理解,因为我做的是针对启动子区的甲基化,首先找到整个基因的完整DNA序列,找到启动子区,然后了解其CpG岛情况,针对CpG岛设计引物,MSP的引物一般是含CpG岛的,而基因芯片检测一般是不含CpG岛的,至于退火温度,可以参考所研究的基因的普通PCR的相关文献.
