PCR仪

请教一下：我用Zymo的试剂盒进行的甲基化处理，作后经过测序效果都很好。最近我有几个模板经过处理以后，条件都没有发生改变,却无论如何也做不出来.而且为了排除试剂问题，我把引物，buffer, dNTP ,hotstar,统统都进行了更换，而且对初始DNA进行了纯化处理，可还是没有结果。我的引物的Tm值为60，片段约400bp.反应体系和反应程序如下：10*buffer 1ul, Q* buffer 2ul, MgCl2 0.6ul, dNTP0.2 ul,hotstar 0.1ul,primerF/R 0.5ul(100ng/ul) ,
template 3ul,终体积10ul.反应程序：95度，15分钟，
94度30秒，62度40秒（每个循环降落0.5度），72度1分钟，共12个循环。94度30秒，50度40秒，72度1分钟，28个循环。
请指导一下，我目前存在的问题在哪里？如何才能尽快扩出我的目的产物？
谢谢

请教一下：我用Zymo的试剂盒进行的甲基化处理，作后经过测序效果都很好。最近我有几个模板经过处理以后，条件都没有发生改变,却无论如何也做不出来.而且为了排除试剂问题，我把引物，buffer, dNTP ,hotstar,统统都进行了更换，而且对初始DNA进行了纯化处理，可还是没有结果。我的引物的Tm值为60，片段约400bp.反应体系和反应程序如下：10*buffer 1ul, Q* buffer 2ul, MgCl2 0.6ul, dNTP0.2 ul,hotstar 0.1ul,primerF/R 0.5ul(100ng/ul) ,
template 3ul,终体积10ul.反应程序：95度，15分钟，
94度30秒，62度40秒（每个循环降落0.5度），72度1分钟，共12个循环。94度30秒，50度40秒，72度1分钟，28个循环。
请指导一下，我目前存在的问题在哪里？如何才能尽快扩出我的目的产物？
谢谢

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回答：原因不太好说。按照能做出的步骤每一步的对照一下，而不要急于更换试剂，更换试剂相当于条件的一次小变动。也不要轻易改变开始的PCR条件，否则容易陷入摸索条件的汪洋大海。我感觉如果不是初始进入修饰的DNA量太少、回收过程中丢失的太多，就是PCR步骤看似不起眼的小细节了，如PCR试管和PCR仪最好选用以前的，加样保证各成分的均匀、一致。

我想问一下楼主，有没有试过不用Clean up kit，直接纯化修饰后的DNA阿？有可行的方法吗？

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回答：建议看一下《分子克隆》中的相关章节。

您好！想向楼主请教一下，做亚硫酸氢钠—PCR和亚硫酸氢钠-测序法所用的引物一样吗？如果不一样，测序法的引物该如何设计？我做的是结肠癌HT29细胞hTERT基因甲基化方面的，请帮忙设计一下，毕业在即，论文的实验还没完成，惭愧！

您好！想向楼主请教一下，做亚硫酸氢钠—PCR和亚硫酸氢钠-测序法所用的引物一样吗？如果不一样，测序法的引物该如何设计？我做的是结肠癌HT29细胞hTERT基因甲基化方面的，请帮忙设计一下，毕业在即，论文的实验还没完成，惭愧！

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回答：设计引物可采用： cuturl('http://www.ucsf.edu/urogene/methprimer/')
免费在线设计。不过引物的可行性需要实验方可验证。建议还是查找文献为主