PCR仪

本人觉得用 promaga的柱子回收DNA效果远不如用 QIAGEN的 DNA纯化回收试剂盒效率高。QIAGEN的盒子是用到玻璃粉回收法。回收效率能达到80－90％

------------------------

很好的经验。

楼主：向你请教，我的模版用TAKARA的ExTaq酶做PCR是光板，但用别人的QIAGEN的酶，却可以做的出来。我看你发的帖子用的也是TAKARA的酶，所以想了解一下你的PCR体系，万分感谢！！！

---------------------------------------

回答：我的体系仅供参考。
修饰后DNA  2μl
10x LA buffer  2μl
2.5mM dNTP   1μl
10uM 引物
（上游+下游） 1 μl +1μl
LA Taq酶   0.3μl
DDW   12.7μl/共20ul。

最近也在作MSP，用的ZYMO的甲基化试剂盒，PCR引物是参考文献的（所见文献几乎用的相同引物），其中一个基因甲基化和未甲基化引物均未P出东西，另外一个基因甲基化引物有条带，但未甲基化引物出现弥散带，提高退火温度也未分出特异性条带。有以下问题请教版主：
1、MSP出现弥散带是何原因，该如何进一步优化条件？
2、考虑其中一个基因已有结果，是否可以认为酶和DNA模板应该没有问题，而未PCR成功的基因该如何调整PCR条件呢？
3、MSP引物到底应该如何查对？实在是搞不懂这个东东，根本无法比对，文献也并未标出引物所对应序列的具体位置，头痛！
版主说：“甲基化PCR使用的引物中未甲基化的C一般转化为U，而DNA中没有U，即为T。下游引物因与序列互补，故而C对应的G变为了A。简言之，上游引物中非CG相连的C应为T，下游引物中非CG相连的C对应的为A。我觉得可以转化后比对一下。引物多，可选择被普遍使用的那一对更好些。”
我也不大明白，引物并未经过修饰怎么会有碱基的转化？按此比对也完全对不上啊，能否简单说明MSP引物与原序列的对应关系。万分感谢！

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

回答：抛砖引玉谈一下引物比对的问题吧。我的办法比较原始。即：1文献中往往会提示目的片段的位置，根据其使用的Genbank号找到相应的基因序列。2：先看上游引物，因上游引物与原序列一致。引物中的T可能是T，也可能是C。尝试将T变为C，反复比对。需要一定的时间。3：可以根据目的片段的长短找到下游引物的位置，然后将原序列中的C变为T，与引物中的A匹配。这个办法比较简单。另一个比较复杂的办法：因下游引物序列与原序列是匹配关系。所以引物中A对应的碱基可能是T，也可能是C。因此，需要反复还原比对。
不知道是否还有更好的办法，因为没有自己设计引物，所以只好费些事研究别人的引物了。呵呵。

您好!
我正在做人类基因SFRP1的甲基化测序检测:针对亚硫酸盐处理的DNA样本P出SFRP1 的第一个预测CPG岛,然后割胶回收,装载体测序.关键问题:p不出任何条带
能帮我分析一下引物吗？

回答：引物应该没有问题。但我感觉您的目的片段有些长，因为修饰后DNA中TA比例增加，片段太长不是很好扩增，您的目的片段有600多个bP。多数文献扩增的片段都在200bp左右，较长片段多用巢式PCR分次扩增。建议：1：目的片段放短；2：做巢式PCR。

楼主：你好！
有几个问题想请教。

欲做甲基化实验，本打算用参考文献中的引物，但发现文献中的RT-PCR引物有问题，因害怕甲基化引物也有问题，麻烦帮着看一下。
该基因为cyclind2，我查的有两个甲基化区，请看序列，[]内为甲基化区

AGAGCGAGCAGGGGAGAGCGAGACCAGTTTTAAGGGGAGGACCGGTGCGA
GTGAGGCAGCCCCGAGGCTCTGCTCGCCCACCACCCAATCCTCGCCTCCC
TTCTGCTCCACCTTCTCTCTCTGCCCTCACCTCTCCCCCGAAAACCCCCT
ATTTAGCCAAAGGAAGGAGGTCAGGGGAACGCTCTCCCCTCCCCTTCCAA
AAAACAAAAACAGAAAAACCTTTTTCCAGGCCGGGGAAAGCAGGAGG[GAG
AGGGGCCGCCGGGCTGGCCATGGAGCTGCTGTGCCACGAGGTGGACCCGG
TCCGCAGGGCCGTGCGGGACCGCAACCTGCTCCGAGACGACCGCGTCCTG
CAGAACCTGCTCACCATCGAGGAGCGCTACCTTCCGCAGTGCTCCTACTT
CAAGTGCGTGCA]GAAGGACATCCAACCCTACATGCGCAGAATGGTGGCCA
CCTGGATGCTGGAGgtaggtcggggggtggcgctcgccaggagccaggac
ccctccggatgctcgggtccccggccggagccctaaacctgggagagggc
aatccccgcgccggcctcccggctcctgtgcgggagtttaccgcgcgcct
tctggcgagacgcgtggctttatttctgttcctctccagataaactgggg
aggcagaggggggaggaaaatctgggagaagcgaggctgtcctgggcggg
ggtaggggagcatcccgcgcgcgtgttcctgcatgtggctgcctcttctt
cccacccccctcgcgacctgtcttttgcgaagccgccgcggctgcttgcg
ctgcggccaggaagagagtcggggcctgaaatcgggaccccgagtagaaa

另一个
gactgagattctgcggttccaacaagctcgcaggtgatgctgatgctgcc
agcccatggaccccacctggagtagtgaggttccttggcactttaagaac
atccctcctttacttcacatttatttctactggaaactagcacagactta
tgcaagctaaattacgcatgttttctccgtaggatgctctatgtcctgtt
cctcttactaacaactctggtctggaccattgttctagGATTGTCTCAAA
GCTTGCCAGGAG[CAGATTGAGGCGGTGCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA
CCGTCAGGACCAACGTGACGGATCCAAGTCGGAGGATGAACTGGACCAAG
CCAGCACCCCTACAGACGTGCGGGATATCGACCTGTGAGGATGCCAGTTG
GGCCGAAAGAGAGAGACGCGTCCAT]AATCTGGTCTCTTCTTCTTTCTGGT
TGTTTTTGTTCTTTGTGTTTTAGGGTGAAACTTAAAAAAAAAATTCTGCC
CCCACCTAGATCATATTTAAAGATCTTTTAGAAGTGAGAGAAAAAGGTCC
TACGAAAACGGAATAATAAAAAGCATTTGGTGCCTATTTGAAGTACAGCA
TAAGGGAATCCCTTGTATATGCGAACAGTTATTGTTTGATTATGTAAAAG
TAATAGTAAAATGCTTACAGGAAAACCTGCAGAGTAGTTAGAGAATATGT
ATGCCTGCAATATGGGAACAAATTAGAGGAGACTTTTTTTTTTCATGTTA
TGAGCTAGCACATACACCCCCTTGTAGTATAATTTCAAGGAACTGTGTAC
GCCATTTATGGCATGATTAGATTGCAAAGCAATGAACTCAAGAAGGAATT
GAAATAAGGAGGGACATGATGGGGAAGGAGTACAAAACAATCTCTCAACA
TGATTGAACCATTTGGGATGGAGAAGCACCTTTGCTCTCAGCCACCTGTT