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标题:甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

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这是我的DNA NaHSO3处理方法:
第1部分:配试剂

1. .配制溶液为高温、高压消毒后无菌双蒸水。(37℃加热后用)
2. NaHSO3和氢醌即用即配,且避光配置和保存。
3.先加部分溶液,溶质溶化后补足溶液体积。
4.NH4OAc配制后需用稀醋酸或氢氧化铵调PH=7.0。
6MNH4OAc: 0.462g +1ml ddH2O
2M NaHSO3: 0.038g + 1ml ddH2O
0.2M氢醌 : 0.022g + 1ml ddH2O
3.5M NaOH: 0.14 g + 1ml ddH2O
3.0M NaOH: 0.12 g + 1 ml ddH2O
我没有对 NaHSO3的PH值进行调节
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我的DNA NaHSO3处理方法:
第2部分:DNA NaHSO3的修饰
1.45ul(一般DNA绝对值2-4ug,加双蒸水定量至45ul)DNA中加5ul 3.5M NaOH,37℃水浴20min。
2.加入517ul 2M NaHSO3及30ul 0.2M氢醌,混匀点离。
3.轻轻覆盖150ul矿物油,EP管口贴封口膜,55℃水浴18小时(或过夜),注意避光。

有个疑问:
实际操作中,我以前曾用石蜡油代替矿物油,但是最终结果都没有DNA,个人觉得可能是石蜡油中的某些物质与DNA产生了结合。后来使用矿物油,其他步骤没有改变的情况下,最终可见沉淀。 所以想请问楼主这个问题是否会对实验结果产生影响?
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我的DNA NaHSO3处理方法:
第3部分:DNA NaHSO3修饰及DNA沉淀
1.吸掉矿物油,吸取300ulDNA至新1.5ml EP管。(剩余DNA-20℃保存)
2.摇匀树脂(可至37℃加热),加1ml到DNA,颠倒混匀。
3.将真空柱和微型柱连接好。(使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统A7280)
4.将混合液加入真空柱中,负压抽吸。
5.80%酒精洗涤3次,弃真空柱。
6.取下微型柱放至新EP管中,10000g,离心2min。
7.将微型住放至新EP管中,加45ul双蒸水(对着微型柱正中白色处深入加液,避免触碰),等待1min。
8.13000g,离心5min,收集EP管中DNA至新EP管,弃微型柱。
9加5ul 3M NaOH 37℃(小枪轻柔混匀) 水浴15min。
10.加50ul 6M NH4OAc(PH 7.0),混匀,加入1ul糖原,250ul 95%酒精,-80℃,2-18h。

由于实验场地的关系,我在-80℃的状况下只能孵育3h左右,不知道会不会对试验产生影响,而且也没对糖原的能否使用进行评价(因为我每次都加了)
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我的DNA NaHSO3处理方法:
第4部分:收集DNA及测浓度和纯度
1.13000g,10min,快速吸干上清,点离,吸上清,收集沉淀(切勿丢失)。
2.加1ml 70%酒精,颠倒混匀,13000g,5min。
3.快速吸干上清,点离,吸干上清(沉淀切勿丢失),稍干燥(管壁上无明显水珠)。
4.加30-50ul 双蒸水重溶(37℃水浴助溶),振荡。
5.测DNA浓度和纯度。
6.-20℃保存

问题:
1。每次沉淀为乳白色,半个芝麻大小,个人怀疑有蛋白污染,但处理前DNA 浓度和纯度都不错,不知道什么原因
2.有人提示TE缓冲液溶解DNA比DDH更好,因为DNA会更稳定,但也有人说TE缓冲液溶解DNA的话会影响DNA的PCR,不知道楼主怎么看?
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请教楼主几个问题:

我的课题是DNA NaHSO3处理后,巢氏PCR产物甲基化测序
引物摘自一篇SCI高影响文章,但现在巢氏PCR的陷于瘫痪状态,条件完全摸不出来,我现在怀疑是我的DNA NaHSO3处理有问题,从而导致DNA模板质量不行,我的方法来源于国外回国一老师,我没动脑筋,完全照搬。不知道是否有问题,而对相关的步骤请教楼主几个问题:
1.是否NaHSO3的配制一定要加碱中和?
2.我的矿物油已经不足,难以继续试验,水浴过程中可以使用石蜡油吗?
3.-80℃的孵育你觉得多少时间比较合适?
4.试验步骤中有什么不对的请指出
5.每次看到沉淀,我就认为是DNA,因为浓度和纯度都不是很理想。18个样本,浓度为5-10ng/ul,个别200ng/ul(可能试验误差),浓度,1.8-2.0的有3个,2.21个,余都为1.2-1.5,不知道大家的结果怎么样?
这样的DNA模板是不是会非常消极的影响巢氏PCR结果?
6.现在试验停滞不前,面临很大压力,每日惴惴不安,不知道大家有什么建议,到底是DNA NaHSO3处理不好还是PCR中要注意什么呢?
7.现在做巢氏PCR的人似乎不多,请问大家在摸条件时有什么经验可以传授,谢谢大家了。  
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针对楼上的问题,我试着谈谈个人看法:
1:NaHSO3应加碱中和,否则PH值太低。
2:我使用的是石蜡油,从结果上看,似乎没有影响。文献上一般是“mineral oil" 。
3:从文献上看,NH4OAc不必调PH至7.0,而是加入相应浓度的NH4OAc后混合液的PH在7.0,起中和作用。因此不同浓度的NH4OAc使用的体积是不同的。您将其PH调节后,应该不能发挥中和作用了。
4:-80℃2小时也应该没有问题,前面有战友回帖,似乎这个时间也是可以的。
5:关于DNA的纯度,除获得其OD的比值外,建议跑一下琼脂糖电泳,观察DNA的纯度。
6:巢式PCR首次扩增的片段一般比较长,个人看法,扩增也不是特别容易,先按照文献所说的条件尝试一下。
另外观看您的体系,与我所使用的修饰体系不同。就一些问题谈谈我的看法。
1:“45ulDNA中加5ul 3.5M NaOH”,一般文献是将DNA稀释至50ul,加3MNaOH5.5ul。如您所述,溶液的中NaOH的浓度似乎大了些。
2:“加入517ul 2M NaHSO3及30ul 0.2M氢醌”,您使用的NaHSO3没有调PH,但使用的体积与常规使用的体积520ul很接近,我认为这会影响整个混合液最终的PH值。
3:“55℃水浴18小时(或过夜)”,个人认为18小时有些长,一般不超过16小时,时间过长,碱基修饰会有逆转。
4:“吸取300ulDNA至新1.5ml EP管。(剩余DNA-20℃保存)”,不知道为何要留一部分?
5:“95%酒精”,应该是3倍体积的无水乙醇。
综上所述,我感觉您的溶液PH可能会对纯化回收有影响。 PCR是下游步骤,只有在保证有足够量的、足够纯度的DNA模板的情况下方能成功。
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请问各位,当你们得到甲基化测序结果以后,把结果作成很多文献上那种黑白小圆点的图,来说明你的那段序列里有多少甲基化的CpG,大家都是怎么做图的呢?自己手画还是有什么小软件可以用?谢谢!

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回答:比对测序的序列后,找出各克隆各位点的甲基化状态,使用画图中的圆形作图。未甲基化的内填充色为白色,甲基化的为黑色,横向为位点,纵向为克隆。
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请问,甲基化扩增的片段克隆后送测序,每次都是没信号,我自己做质粒PCR结果很好,请问春雨濛濛等专家是什么原因,我该怎么办?这件事已经耽搁3个月了。谢谢!

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回答:您的意思是已经有目的片段,并经过凝胶DNA回收,导入质粒扩增,并选取了相应的克隆送检么? 如果是这样,可能:
1:选取的克隆是空克隆,或自连的,没有您的目的片段。
2:因含有高的T,测序可能发生错误。
建议和测序公司沟通一下,或换家测序公司试试。
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刚开始做这个实验,请问您们用的是这个亚硫酸氢钠吗?要加水后反应生成亚硫酸氢钠?下面是说明:
S9000
Sigma-Aldrich Sodium bisulfite ReagentPlus®, ≥99%

As a solid, this product is sodium metabisulfite,.
When dissolved in water, it yields sodium
bisufite NaHSO3.
Na2S2O5 + H2O ® 2 NaHSO3
Sodium bisulfite is a reagent that is used in a variety of
large scale applications. These include the removal of
chlorine from bleached fibers in paper manufacture, as
a disinfectant and bleaching agent for wool, the
preparation of hot and cold indigo vats for dyeing, the
coagulation of rubber latex, and the manufacture of
sodium hydrosulfite.
请做过的朋友帮忙看一下,给点意见,谢谢!

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回答:S9000 没有问题。  
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楼主你好,我现在正作修饰,用的是chemicon公司的试剂合,总是不成功,不知道你是否有这方面的建议
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