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标题:[讨论]做完荧光定量后如何统计数据

HOT兔[使用道具]
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实验中的real-time PCR数据通过机器直接得到:CT平均值(mean CT)、CT值的标准差(CT-SD),我通过2 -△△Ct 公式计算出ddCT值(相对表达水平),但是不知道如何求ddCT值的SD和P值?

举个例子或许更容易说清楚:

House-keeping gene: GAPDH

Target gene: CCL6

Ctrl group:
GAPDH
3次CT值 18.21;17.89; 18.15
平均值:18.08
SD值:0.17222

CCL6
3次CT值 31.79; 32.08; 31.68
平均值 31.85
SD值:0.20903

Experiment group:
GAPDH
3次CT值 19.88; 19.63; 19.78
平均值 19.76
SD值0.12777

CCL6
3次CT值 33.35; 33.07; 33.63
平均值 33.35
SD值:0.27807

这样通过公式求出的CCL6的ddCT=1.132883885

但是如何求这个ddCT值的SD,及其P值大小?

谢谢大家了!

=============================================================================================================

仪器可以算出相对表达量及其标准偏差,但需要设置好仪器。比如基因,样品号,重复等等,随仪器不通而不同但大同小异。然后再根据这个进行统计分析。例如方差分析,t测验等。一般的统计分析应该都学了吧
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麻瓜[使用道具]
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仪器可以算出相对表达量及其标准偏差,但需要设置好仪器。比如基因,样品号,重复等等,随仪器不通而不同但大同小异。然后再根据这个进行统计分析。例如方差分析,t测验等。一般的统计分析应该都学了吧



用T检验或方差分析,只要ddCT就可以,不会用到SD值吧?

仪器一般是三个CT求出平均值后计算ddCT,这样用最后的相对表达量(ddCT)来求P值,不就是要脱离了原来CT值间的差异性?

谢谢指导!
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海鸥crazy[使用道具]
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我最近上了几次定量,做的标准曲线,发现扩增效率一直上不去,总在百分之80

几,R的平方可达到99.9%。

但是第一次是别人帮***作的,扩增效率都是百分之九十几,我又连做了2次,很认

真,很仔细,操作上也没太大问题,并且样品用的和以前一样,只是样品都又稀释了10

倍,但扩增效率就是上不去。这是怎么回事呀,希望有经验者能帮忙分析下可能造成这

个结果的原因,好进一步纠正~~~~谢谢~~~~
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海鸥crazy[使用道具]
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我最近上了几次定量,做的标准曲线,发现扩增效率一直上不去,总在百分之80

几,R的平方可达到99.9%。

但是第一次是别人帮***作的,扩增效率都是百分之九十几,我又连做了2次,很认

真,很仔细,操作上也没太大问题,并且样品用的和以前一样,只是样品都又稀释了10

倍,但扩增效率就是上不去。这是怎么回事呀,希望有经验者能帮忙分析下可能造成这

个结果的原因,好进一步纠正~~~~谢谢~~~~
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饭团团[使用道具]
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请高人指点:如何求ddCT值的SD,及其P值大小
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竹蜻蜓[使用道具]
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请高人指点:如何求ddCT值的SD,及其P值大小


每个样品都有3重复,那么ct值就有标准误SD
ddCT是四个样品(含试验组对照组靶基因内参基因)的CT相比较,4个样品ct的SD相加就是ddCT值的SD。要问为什么?自己看统计学去,另外大学物理实验或者分析化学实验书应该也会提到的。

P值大小用spss算,要不翻统计学书去。
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七彩星星[使用道具]
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我认为2-ΔΔCT计算方法讲解得还不错,但是计算软件我还没有用过,有高手可以指点一下吗?
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章鱼小丸子[使用道具]
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非常感谢,前面战友的帖子,受益匪浅!
但是,我有几个问题想请教一下:
1.如果我是做一个样品在作用因子刺激下,多个基因的表达前后的变化(差不多30-40个不同基因),这样的话,我每个基因都要做标准曲线(如果每个标准曲线5-6个点,每个点有3个重复),这样,是不可能在一个板上进行的,这样怎么消除误差呢?
2.同时,如何能保证所有基因扩增效率都和内参基因一致(2-ΔΔCT法)呢?即使采用Pfaffi法(要求所有目标基因,扩增效率一致(不知道我理解的对不对)),又如何保证所有目标基因扩增效率一致呢?
困惑,希望高人指点!!!
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我是一片云[使用道具]
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请问:我做的实验是析因设计,基因含量检测我做荧光定量PCR,用的染料法,得出的数据(mRNA相对含量的计算用目的mRNA的Ct值减去内参的Ct值得到△Ct,以最大的△Ct作为基准,用其他△Ct减去最大的△Ct并取结果的负值,得到-△△Ct,求得2的-△△Ct次方的结果作为mRNA的相对表达量),用析因设计怎么分析?能举个实例是最好。谢谢了
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小鼹鼠[使用道具]
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求助:
我做的定量实验设计和大家不同,不象大家的实验都有未处理样品,我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况,这些材料只是品质的不同, 在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分:一是目的基因对不同材料的扩增,另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢???

目前我暂用的方法是2-ΔCT法,即:ΔCT(材料1)=CT(材料1目的基因)-CT(材料1内参基因) 然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值,然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学?各位好心人请帮帮忙啊!我就全靠这个结果毕业了!救命啊!

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失望极了,把这个帖子看完了,也不知道这个战友提出的问题最后是如何解决的。我也碰到和他类似的问题。
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