PCR仪

一般有四种，后两者较为完善：

2-delta Ct, 2-delta delta Ct, Pfaffl method(2001; Nucleic Acid Research), Vandesompele method (cuturl('http://genomebiology.com/2002/3/7/research/0034.1'))

是不是每一样品在PCR做3个以上复孔用2--△△CT法得出fold change。每一实验组又要有3个以上重复样品，用这些样品的fold change再去单因素方差分析或者独立样本t检验？

就像我们做western，是把样品重复3次做了，再灰度扫描。因为pcr很精细，人为操作影响大，所以要有3个复孔。

GSS0517 wrote:
我说说自己对数据计算的方法吧。
在说计算方法之前，说明一下，荧光定量的数据是指一个处理中至少有三个样本，每个样本四次重复的数据。
实验完成后，仪器会给出48个数据，12个对照样本目的基因的Ct，12个对照样本内参基因的Ct，12个处理样本目的基因的Ct，12个处理样本内参基因的Ct。接下拉算出每一个样本的平均目的基因和内参基因的平均Ct值和SD，这时的SD值来评判复孔的误差；接下来，利用每个样本内参基因和目的基因的平均Ct值（三个样本）分别计算出处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值和SD，这时的SD值中包括了样本个体间的差异。接下来，利用处理组和对照组的内参和目的基因的平均Ct值相减分别得到处理组和对照组delta Ct，这时的SD值等于计算处理组和对照组平均Ct值时的SD值的平方的和再开方。delta delta Ct值即为处理组delta Ct值减去对照组delta Ct值，标准差与处理组的delta Ct值计算时的标准差相同。最后将上下限的delta delta CT值算出，得到最终的倍数。

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分析透彻啊！但不知为什么“delta Ct的SD值等于计算处理组和对照组平均Ct值时的SD值的平方的和再开方”？

我第一次做定量PCR,
我用的方法是CT法，想检测基因在不同组织，不同时期，不同品种的mRNA表达量变化
1. 样本有400个，（样本有3个重复，既相同的品种组织和年龄，采了三个不同的样本
但是做定量时候没有重复）
2. 使用了2个内参基因

问题：
1.使用方法如果是2-ΔΔCT，我的2个内参应怎么算啊？！
2. 我不太明白公式中的“处理前”和“处理后”
如果是我这个实验，在不同时间的表达量，怎么用“处理前”-“处理后”啊？

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1.不用2个内参吧，都用一个内参就行

2.你的“处理”（即观察因素）是什么？如果是不同时间的表达量的话，最初的时间点就是处理前，其后的时间点就是处理后，处理后的每个时间点再和第一个时间点比较，就得出以后每个时间点相对于最初时间点的量的变化了

我最近在做Real-time PCR 相对定量基因表达，我用的是AppliedBiosystem 公司的机器和软件，我有一个问题想请教您一下：
比如我做不同时间点 0h, 3h,6h, 24h 的某个基因表达量的相对变化，也就是说以0h为calibritor, 3h,6h, 24h 相对0h 的变化量。一般每个时间点设三个重复，但是三个重复的样品的值不可能是完全一样的，有时候差异还很大，在分析时是选 0h-1, 0h-2, 0h-3 三个样品中的一个作为calibritor , 也就是设它的值为1，其它两个的值可能大于1 也可能小于1 ，假设0h-2为 0.7 ，0h-3为1.2， 那么，如果我选0h-2 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都升高了，同样，如果选0h-3 为calibritor , 也就是设它的值为1，那么实际上其它所有样品的相对值都降低了。那么我的问题是到底选哪个作为calibritor 呢。多谢了！

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我最近遇到了和karoleaf同样的问题，我做的有癌组织，癌旁组织，正常组织（N1-N10），每组有10例，每例3个重复，那样的话我分析的时候，应该用哪个做calibritor？N1或是N2或是10个的均数？若是用均数怎么在软件上设呢？用的是ABI7500，谢谢各位了！着急中！