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标题:[讨论]做完荧光定量后如何统计数据

微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在正在做Real time PCR，使用折是Takara Cycler Dice TP800
之前复习了一下资料，结合现在做的实时，与大家分享一下体会：
1.定量的方法有两种：2－△△Ct法和标准曲线法。就我总结相关论文而言，2－△△Ct法要求比较的各基因的扩增效率相同，从实际上来说，即使结果出来，也会受到很多质疑——你为什么使用2－△△Ct，请给出扩增效率的证据来！因此虽然2－△△Ct法可以免去做标准曲线的步骤，但结果的可信度会较标准曲线法降低。而且2－△△Ct法在Takara软件上可以直接计算出结果，如果有人像我这样不是基础专业，只要知道结果是怎么样的，为什么用这样的方法，这就足够了，而不用具体去运算。
2.标准曲线法，可能大家觉的很麻烦。我制作这相对简单，我采用在Real time PCR扩增的产物，如果产物不纯，溶解曲线有多个峰，经过凝胶电泳后可切割下来目的基因的扩增band，用QIAquick Gel Purification Kit将产物纯化并提高浓度。如果溶解曲线只有峰并经电泳证实PCR产物只有目的长度的band，我用QIAquick PCR Purification Kit直接纯化PCR产物。然后用PCR产物纯化后的DNA按10的倍数稀释制作标准曲线，一般纯化后的，我使用的稀释浓度由10的4次方至10的9次方。直线相关非常完美，然后用这个标准曲线定量。用此方法制造标准曲线的方法就是可以节省cDNA模板和得到最高浓度的DNA以制作标准曲线。然后Real time PCR上带的软件可以自动给出相对定量值等。只有代入SPSS进行方差分析或t检验就可以了。
总之，为了省略可信度的质疑，我建议采用标准曲线，标准曲线可以采用Real time PCR的产物纯化后制作。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在正在做Real time PCR，使用折是Takara Cycler Dice TP800
之前复习了一下资料，结合现在做的实时，与大家分享一下体会：
1.定量的方法有两种：2－△△Ct法和标准曲线法。就我总结相关论文而言，2－△△Ct法要求比较的各基因的扩增效率相同，从实际上来说，即使结果出来，也会受到很多质疑——你为什么使用2－△△Ct，请给出扩增效率的证据来！因此虽然2－△△Ct法可以免去做标准曲线的步骤，但结果的可信度会较标准曲线法降低。而且2－△△Ct法在Takara软件上可以直接计算出结果，如果有人像我这样不是基础专业，只要知道结果是怎么样的，为什么用这样的方法，这就足够了，而不用具体去运算。
2.标准曲线法，可能大家觉的很麻烦。我制作这相对简单，我采用在Real time PCR扩增的产物，如果产物不纯，溶解曲线有多个峰，经过凝胶电泳后可切割下来目的基因的扩增band，用QIAquick Gel Purification Kit将产物纯化并提高浓度。如果溶解曲线只有峰并经电泳证实PCR产物只有目的长度的band，我用QIAquick PCR Purification Kit直接纯化PCR产物。然后用PCR产物纯化后的DNA按10的倍数稀释制作标准曲线，一般纯化后的，我使用的稀释浓度由10的4次方至10的9次方。直线相关非常完美，然后用这个标准曲线定量。用此方法制造标准曲线的方法就是可以节省cDNA模板和得到最高浓度的DNA以制作标准曲线。然后Real time PCR上带的软件可以自动给出相对定量值等。只有代入SPSS进行方差分析或t检验就可以了。
总之，为了省略可信度的质疑，我建议采用标准曲线，标准曲线可以采用Real time PCR的产物纯化后制作。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
前段时间研究了相对定量的几种分析方法,个人认为,虽然标准曲线法最早出现也比较经典,但和2ΔΔCt法一样存在扩增效率可信度的问题.
1.2ΔΔCt法默认扩增效率为100%,实际上扩增效率往往在80%~120%之间,从这个角度来说,标准曲线计算出的扩增效率要比用2更准确些;
2.从另一个角度来看,也是一直以来的一个困惑,我认为扩增曲线从起峰开始到达到平台期的循环数,即扩增曲线在拐点处的曲度,体现了反应体系的扩增能力,也就是扩增效率.但从多次实验结果来看,一组曲度很大的扩增曲线(从扩增开始到达到平台期大概7个循环左右)和曲度很小的标扩增曲线(扩增曲线从扩增开始缓缓的上升,始终达不到平台期),在通过标准曲线计算扩增效率时,往往是接近的,差异最多也就是10%左右,远远没有扩增曲线体现的那么明显,从这个角度来说,标准曲线法和2ΔΔCt法的差异也就在相对定量的表达差异是(1+E)ΔΔCt,即1.8ΔΔCt左右还是2ΔΔCt.
除非有另一种新方法,否则在我看来,这两种方法差别不大.
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发表于 2011-9-2 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
REST （the Relative Expression Software Tool）软件, 该软件根据公式amount of target = 2-ΔΔCT的基本原理进行运算，但可以同时使用多个内参照基因和分析多个目的基因，并且允许看家基因和目的基因有不同扩增效率，可以进行精确的运算和统计检验。
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发表于 2011-9-2 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近在做定量，各种方法我进行了比较，绝对定量、相对定量，附件是我阅读的一些文章，总之相对定量是大部分人所采用的方法，绝对定量需要做许多标准曲线，虽然没有扩增效率的要求。我现在采用的方法是用扩增效率校正的Ct比较方法，就是2－△△Ct方法的校正版本，具体见论文，这篇文章发表在核酸研究，应该是有很好的保证的。
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葡萄籽[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问2-ΔΔCT中,-ΔΔCT是2的-ΔΔCT幂次方计算，还是按2减去ΔΔCT来计算呢？
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发表于 2011-9-2 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问2-ΔΔCT中,-ΔΔCT是2的-ΔΔCT幂次方计算，还是按2减去ΔΔCT来计算呢？

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当然是2的-ΔΔCT幂次方计算哦！
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般而言，荧光定量PCR在无须得到精确的数值时是可以采用2的-ΔΔCT幂次方计算进行简便计算。但是前提是两者的扩增效率应该一致。所以在引物设计和片段的扩增长度应该大致一样，约50-150bp左右。一般实验室中对于荧光定量PCR做多个片段扩增，为省钱采用sybr green方法，这只是相对粗略计算，完全可用sybr green方法代替探针精确定量。  
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那请问ΔCT法也是用2的ΔCT的幂次方来计算不同样品的目的基因与内参的ΔCT的数据吗?谢谢!  
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dreaming[使用道具]
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发表于 2011-9-2 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做实时荧光定量PCR，使用相对定量的方法，待测目的基因与标准目的基因的CT比值为A，待测内参照基因与标准内参照基因的CT比值为B。A与B的比值就是目的基因的相对定量。再进行统计学比较。
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