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标题:[讨论]做完荧光定量后如何统计数据

如影随形[使用道具]
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发表于 2011-9-2 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实 2-ΔΔCT是Pfaffi法一种简单的特例，大家可以试试。如果当目标基因和内参基因都等于2时候，Pfaffi法的公式，可以换算成2-ΔΔCT

综上所述，个人认为，你选择方法还是得根据自己实验具体分析来选择，不一定用哪个才是最好的，适合你实验的才是好的

如果上面有错误的，请各位战友指出，我也是新手，也刚刚开始学着分析，呵呵～～～～上面的是我在文章里面看着，加以自己的说法，～～～～～～～
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微笑的海豚[使用道具]
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发表于 2011-9-2 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问题：
1.使用方法如果是2-ΔΔCT，我的2个内参应怎么算啊？！
2. 我不太明白公式中的“处理前”和“处理后”如果是我这个实验，在不同时间的表达量，怎么用“处理前”-“处理后”啊？
最近查看了相关的资料。就楼上说的问题，给点参考意见如下：
我现在使用的伯乐的real－timePCR仪器。
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花裙子[使用道具]
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发表于 2011-9-2 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也有个问题,我做的是绝对定量~得出拷贝值的数据后,用本帖中的方法1双曲线法计算基因差异性,如图,但是将浓度改成拷贝数!

然后又用双delta 方法计算.使用实际扩增效率,即Pfaffi法.

但是得出的两组结果却差别比较大,我很困惑,有哪位朋友遇见过这样的问题吗?我觉得两种方法计算出的结果应该不会差别很大呀~计算的结果数据如下:

A ........ .......... B
1: 0.595 ........ 1.267
2: 0.893 ........ 1.044
3: 0.521 ........ 0.526
4: 0.798 ........ 0.550
5: 1.91 ........ 1.41
6: 1.05 ........ 0.669

其中A是用得双曲线法(将浓度改为拷贝数计算)
B用的 2 -delta delta Ct 方法

感觉两组结果相差挺大,又使用按实际扩增效率计算的Pfaffi法,结果又会变化为:
1: 0.96
2: 0.99
3: 1.11
4: 1.10
5: 1.01
6: 1.05
同样的标本,同样的反应,用不同方法分析的基因表达差异性,怎么有的样本相差这么多呢?

谢谢热心朋友帮忙解答~~~不胜感激!!!!

图为双曲线法,计算时将浓度改为拷贝数(绝对定量使用拷贝数计算基因差异性的方法就这一种么?)


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2011-9-2 16:18
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发表于 2011-9-2 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是RT-PCR的初学者，请问脂肪组织与别的组织做RT-PCR一样的程序吗？它的总RNA提取有特殊要求吗？请各位高手给予指点！不胜感激！
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发表于 2011-9-2 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2-△△Ct法简便易行，但其应用是有前提条件的，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等，PCR反应体系和过程是复杂的，任何微小的影响因素都会造成扩增效率不能一直相同；且随着反应的进行，反应体系中的dNTP消耗，酶活性的降低等因素作用下，扩增效率常常不是1，通常会低于0.6 。因此在实际应用中，2-△△Ct法误差较大,计算出的相对定量结果通常比实际结果偏高。双标准曲线法比较准确可靠，但需要克隆目的基因和管家基因的扩增片段，构建两种质粒获得已知拷贝数的标准品，用于构建标准曲线，这些过程增加了实验的难度和复杂度。
Weihong Liu和David A. Saint推导出了反映PCR早期指数扩增的公式，并且由此推导出了新的相对定量方法。
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冷眼相对[使用道具]
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发表于 2011-9-2 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不需要那么复杂吧。一般考虑两种方法。

一是标准曲线法。在内参基因和目标基因扩增效率不一致的情况下，每次实验都带上两个基因的标准曲线，根据标准曲线推断扩增的量。

二是delta delta Ct法。如果内参基因和目标基因扩增效率一致，那么对于一个sample1，用（X1=目标基因Ct值-内参基因Ct值）进行标准化。比较不同sample时，用标准化后的值，即Xi间的差值进行比较，如（Y=X1-X2)。最后转化成RNA水平实际变化倍数时（sample1相对于sample2），只要N=2^Y就可以了。

建议楼主查看一下这篇文献，主要讲的是delta delta Ct的原理。Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001. 25(4): p. 402-8.

其实我觉得最重要的是内参基因的选择，这是判断RNA水平有无显著变化的关键。我不建议楼主使用GADPH，虽然也能勉强接受。最好是用18S rRNA，这是“金标准”。 而且目的基因和内参基因的片段大小最好在300bp以内，这样无论是扩增效率还是准确性都要好很多。我用的是Takara的试剂盒，结果稳定，效果不错，条件允许楼主可以试一试。

最后关于数据的可信度。一般认为用real-time PCR，其数值变化在50%以内都可以认为没有显著差异，但也有意见认为这个浮动应该控制在20%以内。还有就是每个样品的复孔，最终结果相差0.5个Ct值可以接受，否则就要作为坏值而剔除。

以上意见有些是PCR仪的仪器工程师在讲座中提到的，有的是文献中报道的，有些是我做实验的经验，也有些是试剂公司网站提供的。供楼主参考

[ 本帖最后由 冷眼相对 于 2011-9-2 16:21 编辑 ]
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 小中大
我准备近期做REAL TIME PCR，看完各位高手的分析后，有两个问题噢：
一是：是不是用2-ΔCT的方法就不用参照物呢，直接用处理前后的样品来比较？
二是：用质粒来制作双标准曲线的时候，如果我的样品处理前后的片断是一样的话，那么就是使用同一个质粒来制作标准曲线，这样子就只用一个标准曲线了，就失去了标准曲线相对定量的意义了啊？
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发表于 2011-9-2 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2-ΔCT的方法由于没有内参基因校正,误差很大,不建议使用.
双标准曲线是目标基因和内参基因两条标准曲线,narcissuszxb只用一个标准曲线,我不明白了.
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发表于 2011-9-2 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Pfaffi法中要是对照组和处理组中目的基因的扩增效率E不同的话咋办呀？？
请问楼上各位如何解决这个问题？？
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丸子妹[使用道具]
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 小中大
我要检测某种疾病中A基因的表达与正常人中A基因的表达是否有差异,已经得出该种疾病50例以及正常人5例中A基因的CT值,用 2-ΔΔCT怎么统计患者与正常人中A基因的表达是否有差异.请各位战友指教
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