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标题:[讨论]做完荧光定量后如何统计数据

绿茶公子[使用道具]
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发表于 2011-9-2 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一个问题，比如6个样本，123为对照，456为处理组，得到了以上结果，在进行数据统计时应该用哪一个数值进行统计？dtCT,ddtCT还是2-ddtCT？不同的数值统计出来应该不同吧

===============================================================================================

说了这么多，我觉得还是没有人把如何统计最后结果说明白？
比如这个吧，文献中对照组都是用（1+-标准差）表示的，可是123三个对照组的均值根本就很难是1，除非凑巧是1，那好办了。

有人给解答一下么？
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-2 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好像没有说出个什么明确的思路。
我最近也在处理PCR的数据，就相对定量方法说说我的一些理解和看法。
1.我们的目的：研究一种或者是多种干预对一种疾病（现象）的影响。那么相对定量就需要得出我们的目的基因在某一种（多种）样品中的表达量相对于对照样品的上调（下调）倍数。这是对研究的终极目的－－－统计学上的总体而言。
2.实际操作：我们研究常常是对一个样本进行的。这里就需要从我们研究的样本数据经过统计分析而实现对终极目的的推断。
3.具体的操作：上面好多的战友都说了几种方法，都是有道理的，但是还是说的很粗略。包括我在学位论文数据库中检索了国内多所所谓的“牛”校他们的数据处理方法都是五花八门。而且你很难得看的明白具体的思路！！
例如：20只大鼠随机等分为两组，干预组以“善宁”治疗，对照组不用任何处理。观察“善宁”对肝脏中目的基因白介素－1（IL-1）的mRNA表达的影响。我们的终极目的就是想得到“善宁”是上调（下调）该基因表达的疗效。而此处20只大鼠仅仅是一个样本。要得到这个终极目标，就要用这20只大鼠的样本统计量去统计推断总体参数，才能实现这个终极目标。我们选用B-actin作为内参基因。

前提：目的基因和内参基因的扩增效率和相关系数要满足不同分析方法的前提。不需多说，上面的战友说的很多了。
那么
首先，干预组和对照组中，IL-1基因在相同的样品（肝脏）中的表达需要用内参基因B-actin归一化（人为的假定为“1”）。主要是消除我们取材时候“量”的差异（不能保证相同的细胞数）。
其次，（“善宁”）干预措施的效果是相对（没有处理）而言的，就是说从基因表达角度看，应该理解为：经过干预后，目的基因的表达是上调（下调）了。反应在数据上就是相对于对照样品，干预样品的目的基因上调（下调）了多少倍（这就是“相对”定量的确切含义）。此处就是以对照样品目的基因的表达量再一次的归一化。而实际上，如果在此用对照样品目的基因IL-1的表达量进行归一化处理（人为的假定为“1”），我们就只能得到这10只“善宁”干预组大鼠相对与没有任何处理的对照组的10只大鼠的目的基因IL-1的表达的倍数关系（对样本而言），还不能就说“善宁”能上调（下调）IL-1基因表达。还需要进一步的统计分析才能这样说！因为这一结论是我们的终极目的（对总体而言）。那么此处是两组样本的比较就可以选择t检验达到统计推断的目的。（当然如果是多组的比较可以选择单因素方差分析）。
而恰恰在进行统计推断时，我们面临一个问题！是什么呢？就是我们能得到“善宁”干预组肝脏中IL-1基因相对与对照组的表达倍数的一组数值（10个数据），可是要完成t检验就还需要对照组的另外10个数据，此处我们已经把对照组的IL-1的表达量假定为“1”了，总不能以均数为“1”，标准差为“0”进行统计分析吧！怎么办呢？比较好的办法就是：在上面进行对照组的归一化处理时，我们是用对照组的目的基因IL-1表达的“均数”来假定为“1”的。因此，可以以这个“均数”再次归一化处理对照组中不同样品的IL-1的表达量。这样就可以得到10个数据（此时“均数”不是10个“1”，标注差也不是10个“0”）。以此就可以完成统计分析了。
其实我们大可不必完成后两种归一化处理。直接把“善宁”干预组和“未处理”对照组中已经经过内参归一化处理的目的基因IL-1的表达量（此处的表达量是各个组织中的目的基因“绝对”表达量）进行t检验，得出我们要的结论------“善宁”是否上调（下调）IL-1的表达。
这里，需要说明的是：因为相对定量是相对而言的，所以在进行实验操作时“一定”要把各个样品一一对应起来，这样得出的CT值才能够进行相关的数据处理。理解也很简单，就是说干预组中1号样品的目的基因就必须和1号样品的内参基因的CT值进行相关数据处理，不能把1号样品的目的基因的CT值和2号样品的内参基因CT值进行数据处理！假如这样做就没有起到“归一化”的作用！但是，在用对照组的的目的基因来归一化处理干预组的目的基因时就需要把所有的对照组的目的基因的表达考虑进去了。否则不能得出干预的效果。这也是把对照组目的基因表达的“均数”用来归一化处理干预组目的基因表达的原因。
说了这么多，不知道对大家有没有帮助。请大家指正！
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发表于 2011-9-2 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助：
我做的定量实验设计和大家不同，不象大家的实验都有未处理样品，我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况，这些材料只是品质的不同， 在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分：一是目的基因对不同材料的扩增，另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢？？？

目前我暂用的方法是2-ΔCT法，即：ΔCT（材料1）=CT（材料1目的基因）-CT（材料1内参基因） 然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值，然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学？各位好心人请帮帮忙啊！我就全靠这个结果毕业了！救命啊！
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发表于 2011-9-2 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助：
我是新手。我想请问运用双delta Ct方法进行数据处理后，
最终作图时的标准差值应该怎样计算阿？

具体说：
待测样品中的目的基因和内参，加上对照样品的目的基因和内参
共有4个值会根据PCR重复结果取平均值，那么最后的目的基因相
对表达量值标准差该怎样计算？
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牙牙[使用道具]
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 小中大
求助：
我是新手。我想请问运用双delta Ct方法进行数据处理后，
最终作图时的标准差值应该怎样计算阿？

具体说：
待测样品中的目的基因和内参，加上对照样品的目的基因和内参
共有4个值会根据PCR重复结果取平均值，那么最后的目的基因相
对表达量值标准差该怎样计算？
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发表于 2011-9-2 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问诸位老师，表中的这个数据应该是目标基因和内参基因在同一个管中吧，要是应用SYBR Green I法，目标基因和内参基因是独立的管，应用2-ΔΔCT法，怎么做最后的统计？谢谢！


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 小中大
根据我们的经验，如果所有样品都在同一板中检测完成，利用2-ΔΔCT 和 标准曲线法 得到的结果是一致的。如果比较的样品不在同一板中，建议将同一份样品的目的基因和管家基因放在一起扩增，每块板中都用管家基因制作标准曲线，最后根据目的基因和管家基因的quantity比值，进行比较。这样得到的结果可靠行也很高。  
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发表于 2011-9-2 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是real-time PCR的初做者，看了各位的发言，感触颇多。现有几个疑问，请大家帮忙解答：
我用的是SYBR染料法，拿到引物后首先要看看引物的扩增效率吧？（对cDNA倍比稀释做标准曲线，R2的意义是加样准确与否吗？斜率可以反映扩增效率）如果目的基因和管家基因扩增效率不同，可以用Pfaffl方法做统计，但是这种方法还需要加做一步---看同一基因在不同处理组是否具有相同的扩增效率。那么这一步每个处理组都要做吗？还是只看一两个处理组就可以了呢？
请大家指教！万分感谢!
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发表于 2011-9-2 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问Pfaffi法具体怎么运算呢？
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岸上的鱼[使用道具]
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 小中大
请问Pfaffi法具体怎么运算呢？
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