小中大2.1 2 - △ CT ’ 方法的推导
通过内标 RNA 可以对加入 RNA 的量的差异进行校正。 方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时 PCR 实验的一部分数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候:例如,在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候,这一方法的优势就格外明显。当然我们也可以利用 PCR 实验以外的方法来完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于 cDNA 合成的 RNA 量,然后将相同的 RNA 反转录产生的 cDNA 用于 PCR 定量反应。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里,目标基因和内标合二为一。在这个例子中,公式 [2] 不被公式 [3] 除,公式[ 5 ]变成:
整理得:
任一样品X 0,q 除以参照品 X 0,cb 得:
在这里△ CT’=C T ,q-C T ,cb 。△ C T’ 与前面计算中用的△ C T (用目标基因 C T 值减去参照基因 C T 值)相互区别。
就象在 1.1 部分所描述的,如果条件优化较好,效率接近于 1 ,内标相对于参照因子为: