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标题:[讨论]做完荧光定量后如何统计数据

阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实时定量 PCR 实验设计和数据分析可以采用相对定量和绝对定量两种方法，研究人员在设计实时定量 PCR 实验分析基因表达的时候首先要问的一个问题就是：数据最后会以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要更容易一些，因为它不需要作标准曲线。
本文所给出的公式对于每个用相对定量的方法分析基因表达差异的研究人员都足够了。下面，我们总结一下实验设计和评估中的一些重要步骤：
• 选择一个内标基因。
• 确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响。
• 通过 PCR 扩增目标基因和内标基因 RNA 或 cDNA 的一系列梯度稀释模板确保它们的扩增效率相同。
最后通过 2 - △ CT 计算将统计数据转化成线性形式而不是原始 C T 值。
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清风风铃[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真正说出如何统计的人很少 其实我觉得用2-△△Ct
法时 如果每组 没有做三个样本 只有一个样本 但做了3个以上的重复时,最后的结果是不能统计的 只能得出是对对照组的几倍 我是这样看的 不知对不 要想统计就得做多个样本
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发表于 2011-9-2 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也想知道无论用Delta Ct还是其他方法处理之后得到的比值如何进行统计分析。做方差分析还是做多重比较。如果是以2-Delta Ct为原始数据进行统计分析的话，单位是什么。
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幸福无罪[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做定量，在普通上扩增得到很好的目的条带，无引物二聚体，但是到定量PCR仪上确得不到扩增曲线，换了另外一台定量PCR仪也是如此。各位大侠帮帮忙，找找原因。谢谢了
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发表于 2011-9-2 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不太明白双标准曲线法的公式，所谓的对照样品跟做标准曲线的标准品可以是同样的东西吗？我在做相对定量，但由于目的基因和参考基因扩增效率不一致，所以想采用双标准曲线法，但不知道该如何对数据进行分析。我的样本不是举例中的那种处理前和处理后的样品，而是不同的个体，是收集的病人血样提取的DNA，标准品是构建的含目的基因和参考基因的质粒，标准曲线由质粒10倍稀释获得，请高手指点我该如何统计我的数据获得目的基因相对拷贝数？
非常感谢！ [
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fangxiang[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不太明白双标准曲线法的公式，所谓的对照样品跟做标准曲线的标准品可以是同样的东西吗？我在做相对定量，但由于目的基因和参考基因扩增效率不一致，所以想采用双标准曲线法，但不知道该如何对数据进行分析。我的样本不是举例中的那种处理前和处理后的样品，而是不同的个体，是收集的病人血样提取的DNA，标准品是构建的含目的基因和参考基因的质粒，标准曲线由质粒10倍稀释获得，请高手指点我该如何统计我的数据获得目的基因相对拷贝数？
非常感谢！
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爱哭鬼[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的定量实验设计和大家不同，不象大家的实验都有未处理样品，我的实验只是分析某个目的基因在不同材料中的表达情况，这些材料只是品质的不同， 在做定量的过程中同一个槽子里扩增只分为两个部分：一是目的基因对不同材料的扩增，另外是相对应的用内参基因对这些材料的扩增。所以我很想问一下象我这样的设计用那种相对定量分析数据的方法好呢？？？

目前我暂用的方法是2-ΔCT法，即：ΔCT（材料1）=CT（材料1目的基因）-CT（材料1内参基因） 然后每个材料都这样算出一个2-ΔCT的值，然后比较一下各个材料的2-ΔCT的值。不知这样科学不科学？各位好心人请帮帮忙啊！我就全靠这个结果毕业了！救命啊
看了半天也不知道这个怎吗搞
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 小中大
误差分析有专门的计算公式，是比较复杂的公式，误差涉及到内参和目的基因的的ct误差。各种不同的方法有不同的公式。请参考所用定量分析的软件。
我一般是设置好之后软件自动生成。这就要对仪器配的软件比较熟悉。我是用biorad的CFX96.用pfaffi法处理数据
如果还要自己分析那简直浪费你的软件！只要把所有东西设置好软件会帮你算的好好的。有那时间到这里问来问去还不如把软件弄熟！
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发表于 2011-9-2 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做定量，在普通上扩增得到很好的目的条带，无引物二聚体，但是到定量PCR仪上确得不到扩增曲线，换了另外一台定量PCR仪也是如此。各位大侠帮帮忙，找找原因。谢谢了

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运行程序没有打开荧光收集一项。或其它软件设置不对，。找个熟悉软件的问一下或把文件发给仪器公司的技术指导看看ABI的会帮你分析的
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-9-2 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验中的real-time PCR数据通过机器直接得到：CT平均值（mean CT）、CT值的标准差（CT-SD），我通过2 -△△Ct 公式计算出ddCT值（相对表达水平），但是不知道如何求ddCT值的SD和P值？

举个例子或许更容易说清楚：

House-keeping gene: GAPDH

Target gene: CCL6

Ctrl group:
GAPDH
3次CT值 18.21；17.89； 18.15
平均值：18.08
SD值：0.17222

CCL6
3次CT值 31.79； 32.08； 31.68
平均值 31.85
SD值：0.20903

Experiment group:
GAPDH
3次CT值 19.88; 19.63; 19.78
平均值 19.76
SD值0.12777

CCL6
3次CT值 33.35; 33.07; 33.63
平均值 33.35
SD值：0.27807

这样通过公式求出的CCL6的ddCT=1.132883885

但是如何求这个ddCT值的SD，及其P值大小？

谢谢大家了！
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