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标题:求助:低表达基因如何消除融解曲线双峰?

微笑的海豚[使用道具]
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第一个图Tm值似乎与其他两副不太一样,我个人觉得可以将收集信号的温度设定在83或84度,这样前面的杂峰基本是单链,不影响目的扩增产物的信号收集。
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free[使用道具]
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我想请问一下收集信号温度怎么设呢?

我也遇到了同样的问题啊
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魔法师A[使用道具]
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我们原来也是有这样的打算,可是这样是不能消除在融解曲线的杂峰的,只能在扩增曲线的时候可以这么做。
因为当你做融解曲线时,它是从低温到高温每间隔一温度(如0.5C)采集一次荧光信号的,因为杂峰及二聚Tm值都比产物的低,在升温的过程中,它比产物先采集信号,所以还是不能避免的。
出现这样的情况只有通过优化反应体系来解决!
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free[使用道具]
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我搞清楚了,就是四步法。

在延伸后面在加一个hold step,温度在PDsTm值和主峰Tm值之间,时间为5s
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free[使用道具]
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我们原来也是有这样的打算,可是这样是不能消除在融解曲线的杂峰的,只能在扩增曲线的时候可以这么做。
因为当你做融解曲线时,它是从低温到高温每间隔一温度(如0.5C)采集一次荧光信号的,因为杂峰及二聚Tm值都比产物的低,在升温的过程中,它比产物先采集信号,所以还是不能避免的。
出现这样的情况只有通过优化反应体系来解决!

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可以消除PDs对CT值的影响!
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panda王[使用道具]
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也就是说在延伸后加一步,把温度设定在主峰Tm值水平,进行读版。但是二聚体还是存在,做出来的融解曲线能避免杂峰吗?
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panda王[使用道具]
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那只能是优化条件或者换引物了?
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阿拉蕾[使用道具]
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也就是说在延伸后加一步,把温度设定在主峰Tm值水平,进行读版。但是二聚体还是存在,做出来的融解曲线能避免杂峰吗?

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理论上应该也可以的吧。就是做融解曲线的时候,温度升高时选择高于杂峰的温度开始升温,应该也可以避免。这样的话不仅是在扩增时可以通过选择读版时间避免了非特异性扩增产物或引物二聚体对荧光值的影响,而且融解曲线也可以通过选择起始时间来避免杂峰的影响。
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微笑的海豚[使用道具]
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我们原来也是有这样的打算,可是这样是不能消除在融解曲线的杂峰的,只能在扩增曲线的时候可以这么做。
因为当你做融解曲线时,它是从低温到高温每间隔一温度(如0.5C)采集一次荧光信号的,因为杂峰及二聚Tm值都比产物的低,在升温的过程中,它比产物先采集信号,所以还是不能避免的。
出现这样的情况只有通过优化反应体系来解决!

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在延伸后加了升温低于目的片段的Tm但高于PDs的Tm值,持续5 s的步骤,荧光定量PCR仪在每个循环的最后几秒检测荧光信号,故信号在此时被检测,可以有效的消除PDs对荧光信号的影响.扩增曲线上可以消除PDs,溶解曲线上就不知道了,我也没试过,但是能让结果准确就行了.问一下,读版是什么意思?
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阿福[使用道具]
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感觉第一幅图中79度左右是有些东西,第三幅图好一些,主要原因是第一和第三幅图的表达丰度太低,同时曲线波动的太厉害(需要软件滤波)造成的。
可以稍微提高退火温度试试看。
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