【分享】细胞冻存与复苏

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标题:【分享】细胞冻存与复苏

purrr[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞的冻存是保持细胞系的重要途径，因此掌握细胞冻存技术对实验研究者来说是不可缺少的，现介绍自己成功冻存的经验，与大家共享Big Smile
1 冻存细胞健康程度一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存Black Eye
2 冻存细胞量要多，一般10*6-7/ml，冻存液比例培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定Clown
3 混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存Tongue
4 冻存遵循缓冻速融原则，冻存步骤为-4度30分钟—— -20度1-2小时—— -80度过夜——沉入液氮。也可以用棉花或泡沫塑料封好后直接-80过夜，然后沉入液氮Smile
5 复苏将冻存细胞取出，快速放入37度水浴中待细胞融化后立即取出，超净台上转至细胞瓶中，然后缓慢加入培养基，边加边摇动细胞瓶，最后加20%血清Blush
6 后处理复苏后1-2小时，待细胞贴壁后，缓慢将培养液倒出，加入新鲜培养基，血清（15%），培养3天观察

bring[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

补充：
悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。血清浓度为10％

jude[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 bring 于 2015-8-10 10:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
补充：
悬浮细胞冻存时，DMSO的浓度为5％。血清浓度为10％

能不能说明一下什么理由悬浮细胞就可以用5%的DMSO冻存，因为根据个人有限的资料好像还没有看到哪一本书或教材里提到可以用5%DMSO冻存悬浮细胞。
希望这个5%DMSO的细胞冻存液不会对新手起误导作用，所以必须讲清楚原理。

ns5fan[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在我们这里许多人先直接－20度2小时，然后－70度，复苏后细胞也还可以，不过没有放在液氮里边好，供参考，各位认为有何不妥

www.1[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

细胞冻存还是缓慢冻存好一些，-4度1小时， -20度4小时，-80度过夜，次日放入液氮中。一些简化的步骤有时也是可行的，但我感觉还是循规蹈矩点好，特别是有一些细胞比较娇气，经简化步骤冻存的细胞复苏后活性差的很！

xevin[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想请问一下，前日由于我的粗心，冻存的细胞放在4度十多个小时才记起,再放如-20和-70.不知这样的细胞,复苏好吗

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-8-10 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

冻存的技巧在于细胞的生长状态和冻存液的配制，DMSO的主要作用是防止冰晶的形成，因此如果在4度放置过久，冻存的效果不会好！提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。

qhyu[使用道具]
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发表于 2015-8-10 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xevin 于 2015-8-10 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想请问一下，前日由于我的粗心，冻存的细胞放在4度十多个小时才记起,再放如-20和-70.不知这样的细胞,复苏好吗

细胞在4度存放的时间过长，细胞的活性将受到很大的影响，复苏后死细胞特别多，即使有活细胞其活性也很差。你的细胞在4度已放了十多个小时了，建议废弃，以后注意就行了。

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发表于 2015-8-10 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我冻存细胞时为保持细胞均一性，想一次多冻些细胞，请问用谁用过nunclon 的Triple flask，消化吹打是否容易控制，会不会消化过。谁还有别的方法能一次多冻些细胞？谢谢！

ha111[使用道具]
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发表于 2015-8-10 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

消化后直接用10%DMSO+90%血清冻存即可.....

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