【求助】瞬转、稳转？

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标题:【求助】瞬转、稳转？

11_hjx[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大虾：小弟有个问题搞不明白：
书上说：转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
我的问题是：瞬转指的是否是用真核质粒载体转染细胞，而稳转即要用病毒质粒转染细胞？跪谢！！！

caihong[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

瞬时转染是指转染之后几天之内检测目的基因的表达情况；
稳定转染是指转染之后用相应的药物，例如G418, Zeocin, puromycin等处理细胞，获得目的基因稳定表达的细胞。一般周期比较长，至少需要6~8周。
稳定转染也可以用真核质粒转染细胞，例如pcDNA3.1+,pcDNA3.1/Zeocin等载体。
用病毒转染细胞后，几天之内检测目的基因的表达，之后不做任何处理的话，也属于瞬时转染。

11_hjx[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 caihong 于 2015-8-10 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

瞬时转染是指转染之后几天之内检测目的基因的表达情况；
稳定转染是指转染之后用相应的药物，例如G418, Zeocin, puromycin等处理细胞，获得目的基因稳定表达的细胞。一般周期比较长，至少需要6~8周。
稳定转染也可以用真核 ...

谢谢大虾，您就是说瞬转不需要药物筛选，可是如果不筛选的话，有的细胞质粒转进去了，有的没有转进去，那我后面测RNA和蛋白不就不准了吗？小弟刚刚开始做这个，望大虾指点，跪谢！！

caihong[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大虾不敢当。
瞬时转染的话，转染效率的确会在批次之间所有差异。有的细胞质粒转进去了，有的细胞质粒没有转进去。同时，随着细胞分裂细胞数的增多，质粒会逐渐丢失。
若只是简单的看一下，目的蛋白在宿主细胞中是否表达以及分子大小，可以采用瞬时转染。
但是瞬时转染有的时候会是假阴性，就是瞬时转染检测不到，但是经过加压处理之后，能获得稳定表达该目的基因的细胞系。

xevin[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 11_hjx 于 2015-8-10 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢大虾，您就是说瞬转不需要药物筛选，可是如果不筛选的话，有的细胞质粒转进去了，有的没有转进去，那我后面测RNA和蛋白不就不准了吗？小弟刚刚开始做这个，望大虾指点，跪谢！！ ...

瞬时转染只是质粒进入了细胞核并表达，由于其不能复制，随着细胞不断变多，平均每个细胞中的质粒数不断变少，效果不断降低，直至消失。
稳定转染是在瞬时转染的基础上产生的，由于转入细胞核的质粒有很小的概率整合进宿主的基因组中，所以可以用一些抗生素将这种细胞筛选出来并扩大培养，由于质粒稳定的进入了基因组，所以效果稳定存在。
稳转还是顺转主要还是和实验目的有关，区别是一种基因对细胞短时或是长时的影响，看到的效果可能不同甚至相反。

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 caihong 于 2015-8-10 17:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

大虾不敢当。
瞬时转染的话，转染效率的确会在批次之间所有差异。有的细胞质粒转进去了，有的细胞质粒没有转进去。同时，随着细胞分裂细胞数的增多，质粒会逐渐丢失。
若只是简单的看一下，目的蛋白在宿主细胞中是否表达以及 ...

您好！
我最近做“pcDNA3.1-目的基因”载体的瞬时超标达，C2C12、HepG2都做过，转染后6小时换液，再过24小时后收样提取RNA，检测不到超标达，以为是质粒的问题，可是换了其他几个质粒依然没有超表达，这跟假阴性有关吗？到底如何才能得到高的瞬时超标达效果呢，求指点，谢谢

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发表于 2015-8-10 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 bs4665 于 2015-8-10 17:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！
我最近做“pcDNA3.1-目的基因”载体的瞬时超标达，C2C12、HepG2都做过，转染后6小时换液，再过24小时后收样提取RNA，检测不到超标达，以为是质粒的问题，可是换了其他几个质粒依然没有超表达，这跟假阴性有关吗？到底如何才能 ...

你提取RNA来看蛋白的表达并不是很科学的。RNA只能反映基因转录的情况，RNA有没有被翻译产生蛋白质是检测不到的。一般测定蛋白表达都是用直接的WB或FACS分析，通过抗体检查目的蛋白。结果直接，操作简单，也不容易出错。
你怀疑没有表达，建议做一个阳性对照检查转染的效率，用GFP或其它表达过的载体都可以。另外，载体测序也是很重要的，要确定DNA序列没有问题。一般要检查ATG附近的Kozak序列，以及有没有移码，有没有终止子。

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 iii_ii 于 2015-8-10 17:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你提取RNA来看蛋白的表达并不是很科学的。RNA只能反映基因转录的情况，RNA有没有被翻译产生蛋白质是检测不到的。一般测定蛋白表达都是用直接的WB或FACS分析，通过抗体检查目的蛋白。结果直接，操作简单，也不容易出错。
你 ...

因为没有抗体，所以先检一下mRNA水平。DNA序列我确定没有问题，质粒也没有问题，下次做的时候同时转下GFP，谢谢您给的意见

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发表于 2015-8-10 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没有合适抗体的话，建议你也可以考虑加一个标签，如HA，FLAG等，便于以后检测。小标签一般对蛋白功能影响还是比较小的。也可以做功能性实验，不过要麻烦很多。

is2011[使用道具]
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发表于 2015-8-10 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那人说至少需要6~8周，但我感觉2~3周就做出来了。

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