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标题:【求助】LIPOFECTAMINE 2000转染问题若干

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发表于 2015-8-10 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

汇报结果：
用LIPOFECTAMINE 2000有血清状态下转染293T细胞，不换液，48H后收集细胞，准备做WB。用GFP做效率对比，，感觉不错（见图），约60%-70%被转染成功。
心得体会：
1、LIPOFECTAMINE 2000现在可以在有血清的状态下转染，省力。
2、质粒用量不能按说明上来，eg,10UL的LIPOFECTAMINE 2000加4UG的质粒根本达不到效果，至少要6－8UG质粒才可保证明显的结果（因为我的蛋白分子量大，约250KD）。
3、视细胞死亡情况看换液与否。我与技术支持联系过，他们说每一个批号的LIPOFECTAMINE 2000毒性有差别，要视情况而定是否换液。
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ffaa[使用道具]
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发表于 2015-8-10 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是用lipofectamine 2000转293, 我感觉lipo 是有一定的细胞毒性,但对于比较tough的细胞,比如CHO, HepG2来说，这种毒性根本不明显,293是很picky的,根据我的经验,转293时:第一,细胞状态要好,第二,细胞密度要够,按照说明书上的说法,是要求90~95%的confluent.还有,我一般是转染后5.5h换液,work的挺好,细胞也没死.其他的都是按照说明书上来的.
养293的同志们,大家一起努力吧!
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nikun230[使用道具]
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发表于 2015-8-10 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第二次实验几天前就做了，因为最近比较忙，今天才来。
再向大家汇报下我的第二次实验结果：
这次转染我做了如下改进：
1.提高铺板密度
2.转染时间稍微延迟（在36小时转染，此时细胞状态已经很好)
3.lipo2000的量稍微减少——六孔板，每孔4ul。质粒每孔2ug。
转染后5小时，我基本没有发现细胞状态有明显改变（第一次时，有很多细胞都飘起来了）。但是为了保险起见，我还是在6小时的时候换了培养基。转染后48小时提蛋白，跑WB验证，目的蛋白含量很高。转染成功！
总结经验：
铺板密度要高，转染时机的选择应该是细胞状态好的时候，不一定要铺板后24小时。
补充下，我用的是293细胞。
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发表于 2015-8-10 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有没有人传授一下转染HepG2细胞的经验？
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发表于 2015-8-10 18:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
有人做过446细胞转染吗？ 求经验
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土坷垃[使用道具]
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发表于 2015-8-10 18:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
46XX性发育睾丸疾病
求助：
1、我想转染H446细胞，大家有转染过这个细胞系的吗？用的那种转染试剂？转染效率如何？
2、大家从哪个代理公司买的lipofectamine 2000，多少钱？
感激不尽
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veiwu[使用道具]
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发表于 2015-8-10 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢楼主分享心得。
本人初次做293T细胞，有以下问题想问问大家~
1.293和293T到底有什么区别呢？如果我想做电生理，选哪一个比较好？
2.我养了293和293T，细胞看着状态挺好，增殖也很快，但是高倍镜下细胞里面会有黑色的渣渣样的东西，培养液很干净，不像是污染，请问大家有见过这种情况吗？
3.Lipo转让以后做膜片钳，细胞封上以后破膜总是掉，这个原因是什么呢？
希望各位多多指教~
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toy[使用道具]
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发表于 2015-8-10 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 veiwu 于 2015-8-10 18:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

感谢楼主分享心得。
本人初次做293T细胞，有以下问题想问问大家~
1.293和293T到底有什么区别呢？如果我想做电生理，选哪一个比较好？
2.我养了293和293T，细胞看着状态挺好，增殖也很快，但是高倍镜下细胞里面会有黑色的渣渣样的 ...

我不是转293，但是转染后高倍镜下是看到背景有小黑点。培养液倒是很干净，只是我的细胞在转染后生长速度似乎明显减慢了。。
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