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标题:RT-PCR讨论区

海鸥crazy[使用道具]
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我一直再做RT-PCR,可以一直都有问题!我提取的RNA纯度挺高的,RT-PCR用的是保生物公司的试剂盒,两步法来完成的,可以不知道为什么就是没有结果,希望高手指导!
谢谢
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柠檬籽[使用道具]
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我也是一个新新手,最近做RT-PCR怎么咽做不出来结果。请问一下各位大虾,我做的是心肌细胞c-fos mRNA的表达量变化。请各位大虾看一下我的引物和体系,看一下是什么问题?
c-fos:上游引物 5'-CAC GAC CAT GAT GTT CTC GG-3'
下游引物 3'-TGG CTC TAA CGG TTA GAT GA-5'
转录用的oligo dT15(promega)、MMLV逆转录酶
PCR体系:
5ul cDNA
1ul dNTP(10mmol/l)
5ul 10xbuffer
1ul TaqE(2u/ul)
2ul c-fos 上
2ul c-fos 下
3ul MgCL2(25mmol/l)
加ddH2O到50ul
退火温度从55度到59.5度做过梯度,都没有目的条带(文献上说是348bp)。用Primer 5.0它推荐退火为43.5度,我今天做了还是什么也没有!
不知是何原因呢?是引物设计的问题吗?
c-fos mRNA在GenBANK的序列号为X06769
用上述条件和温度内参跑得很好很干净
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兔纸[使用道具]
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Hi,我是新手上路,现在课题很急,需要有关real-time RT-PCR 的资料和各位的经验,请多指教。
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阿福[使用道具]
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谢谢
请问用TRIZOL从血清中提取丙肝RNA没有看到沉淀,结果也没有做出来是不是提取的问题啊,还有去除上清仍有少量可不可以烤一烤,温度是多少啊

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看不见沉淀是不是你用的组织太少了,增加组织量,试一试。不懂你的“去除上清仍有少量可不可以烤一烤”是什么意思。我用自己配的试剂提RNA,可能和试剂盒的方法有区别。
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阿福[使用道具]
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本人在做RT-PCR遇到一怪现象,即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢? 请高手指教!

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得到许多非特异性的条带的组织是否存在不同剪接
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我做的是从血清中提取丙型肝炎病毒的RNA 没有组织,做了十几次RTPCR都没有做出来,不过原因找到了,是我的胶有问题,又从垃圾堆里把以前的找出来从新跑了一下,都出来了,真是一招不慎全盘皆输啊
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还是孩子[使用道具]
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我是新手,最近在作rt-pcr时,我的目的基因条带出来了,但出现了一条亮度非常高的非特异性带,每次每个标本都出现。我已把镁离子浓度和退火温度做了调整,但效果不佳。引物以前用过,没有问题,pcr条件差不多也有此非特异性带,但没这么明显,这次却怎么也弱不了它。期待各位的帮助,谢谢!!!
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阿拉蕾[使用道具]
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我是新手,最近在作rt-pcr时,我的目的基因条带出来了,但出现了一条亮度非常高的非特异性带,每次每个标本都出现。我已把镁离子浓度和退火温度做了调整,但效果不佳。引物以前用过,没有问题,pcr条件差不多也有此非特异性带,但没这么明显,这次却怎么也弱不了它。期待各位的帮助,谢谢

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模板一样么?
大小?
实在不行抠下来测序。
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queen[使用道具]
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大家好,我现在要从人肝中提取apoA-1的MRNA全长,然后RTPCR得到它的全长DNA.工900个BP 问还有什么困难和问题吗
哪位老兄给我 这方面RTPCR的资料啊
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queen[使用道具]
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高手好,小弟这厢有礼了。《1》问:我现在有人肝组织的总RNA,RT是用a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer 设计的引物 能把所有的蛋白的CDNA都反转录出来吗,其他的我不管。我的目的基因是APOA-1。全厂900不到。
《2》问我用A 法B法 能得到我的AOPOA-1的CDNA吗。我的APOA-1全长900左右,它对RNA的提取和RT的要求是不是很高。
《3》问我的RNA是我师姐给的。在-80度冰箱里防了差不多有一年了,问还能用吗
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