PCR仪

1. 最好按照说明书的操作来进行试验，这个盒子效果一般，样本量最好不要超过1ug，如果超过对你的pcr体系会有影响，因为它的酶有一定要求。
2.你要P 1500bp 最好用高保真的酶，这个盒子恐怕不能满足你的要求。如果不用高保真的酶，那很可能出现错配。你的目的产物下一步是用来干什么的？如果是要表达，那一定要用高保真的酶；如果只是作半定量，那还可以勉强。不过最好p完后测一下序。建议用高保真的酶。
3.你的引物温度相差不是很大，我一般从温度较低的一个开始，如：ＦＯＲ－５６.４度　ＲＥＶ－５５.０度 那么我就用55度。其他地按照说明书即可。
4.结果没出来，很大原因RT那步的产物有问题。还可能是操作过程中的问题，如忘记加试剂等。本人以为TAKARA的这个盒子虽然很便宜，但不是很好用，相对来说一步法盒子好一些。而且这个盒子的量不足。最好能用invetrogen的盒子，但可能贵一些。


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说的有道理,我的一个师姐用此盒子就出现了错配,
我的师姐告诉我他们RT用的总RNA达到1-5UG.结果出来了. 如用高保真的酶,问题是此酶,有没有3'到5'的外切酶活性,我想用T载体连接.怕没有 了AA末端.

你可以查一下或向代理询问一下。应该有没有3---5 外切酶活性的高保真酶。你连接后要干什么？
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表达

表达

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如果是表达，那你一定的用高保真的酶了，如果不用，那表达出的蛋白就不是你想要得蛋白。看看invetrogen有没有你要的酶，他的酶是最好的，但是很贵！还有就是没有不具备3-5外切酶活性的高保真酶，之所以叫高保真，就是因为它有这种活性。
我给你一个方法可能管用，不是我做过是我同学这么做过，效果还行，你借鉴一下吧。首先先用高保真的酶P出目的基因，然后再用普通的酶在适宜的条件下温育即可加上AAAAAAAA的尾巴，可以和T载体相连。
不妨试一试，祝好运！

请问用TRIZOL从血清中提取丙肝RNA没有看到沉淀,结果也没有做出来是不是提取的问题啊,还有去除上清仍有少量可不可以烤一烤,温度是多少啊

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去除试管底的少量液体时，不必烤，可以再拿去离心一下，再用10或100 ul的枪小心吸取液体（注意不要让枪头接触管壁 ），然后直接以DEPC 水溶即可

听细胞组的老师讲，他们是把培养液加满带的！
一两天是没问题的，不过要小心污染！

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回答基本正确，详见《体外培养的原理与技术》绿皮，精装，作者记不住了

请教关于RT-PCR的技术

我也想求助一下RT-PCR.我要从脾淋巴细胞中扩一个禽细胞因子.用的是上海华舜的RNA提取试剂盒.我需要的长度是700BP左右,扩了几次出来,但拿出去测序结果都不对.不然就扩不出来.用总RNA在普通的琼脂糖上跑电泳你10分钟时,能看到两条清晰的条带.19分钟只能看到一条清晰的条带,在点样孔较近的条带出出现类似RNA分解样的东西.请各位高手给我分析一下原因好吗.都做两个多月了都还是错的.我都快急死了.

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原因可能有以下几点：
1）华舜的RNA 试剂盒不是太好用， 提的RNA不是很纯。你所提到的总RNA电泳有图吗？一般正常应该有三条带，28s，18s，5s。但如果RNA质量很高，5s是看不到的，28s应该是18s亮度的两倍。加样孔附近出现的不一定是RNA降解的产物，很大可能是DNA！
2）扩出的不是你想要的目的片段，很大程度说明你的引物有问题，可能有错配！仔细到NCBI上去比对一下，如果是马上重新设计引物！

rt-pcr 时，RN A  和CDNA 都需要测浓度吗