PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » RT-PCR讨论区

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:RT-PCR讨论区

花裙子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70428
精华 0
积分 179
帖子 137
信誉分 100
可用分 1376
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
11
 
本人在做RT-PCR遇到一怪现象,即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢? 请高手指教!
顶部
章鱼小丸子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70431
精华 0
积分 177
帖子 113
信誉分 100
可用分 1281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
12
 
做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候,用什么方法处理装提取物的玻璃管?多谢!!
顶部
阿福[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 69991
精华 0
积分 269
帖子 277
信誉分 100
可用分 2146
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
13
 
做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候,用什么方法处理装提取物的玻璃管?多谢!!

===========================================================================================

我们一般测定浓度后把测定用的少量样品丢掉
顶部
free[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71299
精华 0
积分 298
帖子 276
信誉分 100
可用分 2226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
14
 
做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候,用什么方法处理装提取物的玻璃管?多谢!!

以去离子水洗3次,每次洗完后甩干.
顶部
蒲公英[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70433
精华 0
积分 232
帖子 203
信誉分 100
可用分 1761
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
15
 
“用什么方法处理装提取物的玻璃管”
此处的“玻璃管”应当是石英比色杯吧。处理方法如verygood朋友所言。
如果RNA浓度较高,恐有污染而影响下一批次的样品测定,可以用5%的盐酸浸泡过夜,然后双蒸水洗净备用。

处理石英杯不能象处理其它RNA实验相关器材那样用碱泡,因为二氧化硅是可以与强碱反应成硅酸钠,强碱会腐蚀比色杯。

使用比色杯时,注意不能用手指触摸透光面,防止皮脂或汗液弄脏表面,影响测量精度。如不小心弄脏,可用擦镜纸揩干净。
顶部
阿拉蕾[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 69963
精华 0
积分 511
帖子 701
信誉分 100
可用分 4251
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-3
状态 离线
16
 
做RT-PCR后用分光光度剂测量RNA量的时候,用什么方法处理装提取物的玻璃管?多谢!!
如果你还想要RNA,就按照分子克隆上的方法处理。

=======================================================================

用微量比色杯时,去离子水洗10次,每次洗完后甩干最好用真空泵把水吸干。
顶部
荷塘青蛙![使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
17
 
以下是一些RT-PCR的技术操作及相应文献参考:有意者可从中得到一些启示。
. cuturl('http://www.research.umbc.edu/~jwolf/m12.htm')(UMBC)
First strand synthesis and subsequent PCR amplification. Based on LTI protocol

. cuturl('http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols/revtrpcr.html')(NWFSC)
Procedure for cDNA synthesis on dynabeads oligo(dT)25

. cuturl('http://gause.usuhs.mil/rt.html')(Cause's Lab)
Detailed protocol for RT and PCR

. cuturl('http://wheat.pw.usda.gov/homepage/lazo/methods/lazo/revtrpcr.html')(Lazo Lab)
First strand cDNA synthesis and PCR amplification

. cuturl('http://www.biol.rug.nl/lacto/protocols/superscript.html')
Procedure either for RT-PCR and primer extension. For primer extension, just add hot dATP

. cuturl('http://www.microbiology.med.umn.edu/immunology/cDNA_RT-PCR.html')(Immunology Resource)
CDNA synthesis from mRNA and subsequent PCR amplification

. cuturl('http://zapruder.pds.med.umich.edu/users/Frank/HepC/HepC.html')(Hans Popper)
This protocol is for the non-isotopic detection of hepatitis C RNA and albumin mRNA (as an internal control) from 4 micron sections of formalin-fixed, paraffin-embedded liver biopsies by RT-PCR. The procedure for RNA extraction from formalin fixed paraffin embedded section and PCR amplification is described.
顶部
荷塘青蛙![使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71340
精华 0
积分 237
帖子 213
信誉分 100
可用分 1771
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-24
状态 离线
18
 
本人在做RT-PCR遇到一怪现象,即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢? 请高手指教!

===============================================================================================================

我也遇到这样的问题,我想是不是两种组织中目的基因的数量差异很大。
同时,我做的是半定量RT-PCR,但是其实很难做到半定量,因为过程中有很多不确定因素,比如测定RNA浓度,然后固定RNA的量进行RT-PCR,至少测RNA浓度时就不能确保完全一致。当然我同时也做了内参。
顶部
+田田+[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71224
精华 0
积分 216
帖子 192
信誉分 100
可用分 1691
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
19
 
最好用DEPC水冲洗几次。虽说测量时间较短,仍应尽量防止RNA降解。我的做法是,测量时取少量提取产物用DEPC 水稀释,测完后弃之。
顶部
嗡嗡[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 70430
精华 0
积分 168
帖子 75
信誉分 100
可用分 1106
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-10
状态 离线
20
 
本人愚见如下:
1.RT-PCR有两种做法:
条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。
2.RT-PCR应具备的条件
高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。
3.RACE
我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无想法,求助!
顶部