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标题:RT-PCR讨论区

小鼹鼠[使用道具]
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发表于 2011-9-6 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问各位大侠：
             RNA提取后需较长时间储存，需加RNA酶抑制剂吗？浓度是多少？
谢谢！
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@花开花落@[使用道具]
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发表于 2011-9-6 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我提取RNA用的是QIAGEN 公司的RNeasy MINI KIT
效果还好。而且样本间的均一性也可以呀。OD260/280总能在1.6-1.98之间
后来我又用trizol提取，却总是得不到满意结果。比值一直到不了1.4 我用酚氯仿抽提了两次还是不成。而且，每次都会有些RNA损失。真奇怪。大家得OD比值是多少呢？
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牙牙[使用道具]
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发表于 2011-9-6 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的RT-PCR有多条band,不知原因，请各位 帮忙。

在RT时，引物设计Random Primers 和Oligo dT-Adaptor Primer那个更好，我用的是Random Primers ；AMV RT 与MMLV RT 那个更好，我用的是AMV RT。

PCR时，我全选gene, 后用Primer 3.0 选primer 100bp~200bp. 同学说还是先选Gene的前1000bp,用此1000的前两行选一个primer，用此1000的后两行选另一个primer.更专一性一点，又可与primer dimer 区别。想问的是这一方法是否更好，是否更难批出产物，primer dimer 是否难以避免，因我看到有些公司的mannual的pcr图中都有primer dimer bands。我的primer Tm 为60度是否太低。

我的pcr 条件：

94oC, 2min
94oC, 30S
55oC,60S
72OC,45S
30cycles
72oC, 7min

另外pcr 时，这样减少蒸发，用加热的盖?

Fang CY，请给我一张RNA电泳图吧，非常感谢。xiaoyun0031@hotmail.com
不知那位有Primer 5.0.

非常感谢各位化时间看我的贴。
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HOT兔[使用道具]
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发表于 2011-9-6 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。
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发表于 2011-9-6 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在做丙型肝炎荧光定量PCR方面的东东,
各位高手有什么建议啊
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荷塘青蛙！[使用道具]
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发表于 2011-9-6 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
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阿福[使用道具]
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发表于 2011-9-6 16:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在香港用过一种试剂，里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了， 提RNA时所用的仪器，耗材如不能用DEPC泡，或来不及处理，用它擦一下就可以了，很方便的。如有条件买瓶试试。

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Protector RNase Inhibitor？ Roch的好像是。
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丁香@@[使用道具]
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发表于 2011-9-6 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了两个多月的半定量RT-PCR，用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时，怎么也得不到一致的量，是不是RT之后，用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理，驱除RNA，然后再测cDNA的浓度，再以相同的模板量进行PCR，就可以了？假如采用一步法，要定量的话，测完各个样品的RNA浓度后，以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了？
热切盼望哪位高手帮助！
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发表于 2011-9-6 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做了两个多月的半定量RT-PCR，用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时，怎么也得不到一致的量，是不是RT之后，用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理，驱除RNA，然后再测cDNA的浓度，再以相同的模板量进行PCR，就可以了？假如采用一步法，要定量的话，测完各个样品的RNA浓度后，以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了？
热切盼望哪位高手帮助！

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sorry i can not type chinese now.
it does not need RNase-H digestion,beside the single strand of cDNA is different. the Pcr procedure is changeable and not standerd in dfferent time. so u should do inner control every time and caculate the ratio of target gene and housekepping gene.
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果冻也酸[使用道具]
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发表于 2011-9-6 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我想请教各位，我的RNA抽提260/280在2.0左右，RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做，然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带（2.0％琼脂糖），是否为引物二聚体？可能是什么原因？CDNA合成失败？PCR条件不妥？我怎么检验CDNA的合成，紫外分光法，值是？希望大家赐教。
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