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标题:RT-PCR讨论区

微笑的海豚[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 果冻也酸 于 2011-9-6 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大家好,我想请教各位,我的RNA抽提260/280在2.0左右,RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做,然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带(2.0%琼脂糖),是否为引物二聚体?可能是什么原因?CDNA合成失败?PCR条件不 ...

应该是引物二聚体。我在做实验的时候,也碰到这些情况。但我同时还得到我的目的带。检验cDNA第一链的合成,可以跑一下电泳,有一条从点样孔到溴酚兰之前的发散的光带。直接用紫外分光法测好象不准,因为同时还有RNA。RT的产物是单链CDNA和RNA的杂交体。
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椰子叶子[使用道具]
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我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的,因为我有很多个样品,不同发育阶段的,所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量,等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后,每一条带的亮度一致以后,我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了,还是调不一致,CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼!
能否具体地告诉我该怎么做?万分感激!
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fangxiang[使用道具]
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不要去费力调整什么一样的上样量,当然,如果量一样,发的图好看一些,但和花的功夫比,实在没什么一丝。
每次做PCR的同时都做内参照,内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度(是相对,很多国内文章把这都搞错了)。
我们以前都是在同一贯中,但是这样两对引物之间会有干扰,你可以作作看看有多可怕。
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椰子叶子[使用道具]
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你说的关于通过电泳的方法看cDNA的方法恐怕太奢侈了吧。多么宝贵的cDNA啊!
其实还是万能的内参照,做一下任何常见基因就可以来,尤其是以前作过的。
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羊咩咩[使用道具]
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我已经用了inner control.我就是用housekeeping-gene来做inner control的,因为我有很多个样品,不同发育阶段的,所以我想先用housekeeping gene做PCR来调每个样品的起始模板量,等到每个样品用housekeeping gene primer扩出的产物经电泳后,每一条带的亮度一致以后,我再用同样的模板量以特异引物PCR。这样得到的结果我就当作是半定量的结果。可我调了2个多月了,还是调不一致,CDAN模板也降解了。所以现在我又要从头做起。头疼!

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我想,重要的是在RT过程定量,各样品RNA要尽量准确测定浓度,反应体系除了RNA外作成N+1份mixture,准确分装,准确加入等量RNA,问题应该不大。
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fangxiang[使用道具]
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多谢两位高手的答复。我现在终于茅塞顿开了。我知道怎么做了。万分感激!
对,用电泳检测cDNA的合成确实很浪费,我们一般也没有这样做。不过我的同学有这样做的。有时候为了检测cDNA是否已降解,偶尔跑一下电泳。
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fangxiang[使用道具]
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关于半定量

RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度

我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?  
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椰子叶子[使用道具]
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sorry cannot type chinese now. i maybe write in chinese later.
for <Biowind>
of couse it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.
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在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。
关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3、5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。

To biowind
愚见采用从RNA定量的方法似不妥,不要说PCR的本身的敏感度,即便是再反转录就有差异,到了cDNA的分装和用于模板的取样,这些都不能保证准确,当然再反转录阶段我们也野葛控制在1或4ug,但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多,而且尽可能的利用反转录魅,而且RNA定量本身及时用电泳也不是那么准,所以比较不同标本之间就更不准了。胡言乱语,仅供参考。
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loli[使用道具]
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我前后两次用一步法做rt-pcr,温度和试剂浓度等条件都相同,用的是同一种引物,电泳结果第一次有且仅有一条600多bp的带,而第二次却有且仅有一条500bp的带。如果引物的特异性强为什么相同方法作两遍会出现两条bp值不同的带,如果引物特异性不高又为何每次只有一条带。我百思不得其解:(!(另:引物设计时是233bp)
各位高手指点一下吧!
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