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标题:RT-PCR讨论区

麻瓜[使用道具]
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有没有人用过SEEGENE公司的DNAFISHING KIT 呀?
怎么购买呢?
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飞天小鹿[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 麻瓜 于 2011-9-6 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有没有人用过SEEGENE公司的DNAFISHING KIT 呀?
怎么购买呢?  

国内没有代理商。不好意思,当初推荐的时候没考虑这点。
香港的代理商信息如下:
Line Analytics, Ltd.

1407B Sea View Estate 2-8 Watson Rd. North Point,
Hong Kong
Tel: (852) 2578-5839
Fax: (852) 2807-2674
E-mail: line@lineanalytics.com
URL: cuturl('www.lineanalytics.com')
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丁香@@[使用道具]
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愚见采用从RNA定量的方法似不妥,不要说PCR的本身的敏感度,即便是再反转录就有差异,到了cDNA的分装和用于模板的取样,这些都不能保证准确,当然再反转录阶段我们也野葛控制在1或4ug,但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多,而且尽可能的利用反转录魅,而且RNA定量本身及时用电泳也不是那么准,所以比较不同标本之间就更不准了。胡言乱语,仅供参考。

mxbdna2003,假如我用一步法做,RNA先测浓度,然后以相同的量进行RT-PCR,同时做内参,这样行不行呢?还有我有
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阿拉蕾[使用道具]
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RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。  
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阿拉蕾[使用道具]
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我在香港用过一种试剂,里面含RNase inhibitor, 但记不得叫什么名字了, 提RNA时所用的仪器,耗材如不能用DEPC泡,或来不及处理,用它擦一下就可以了,很方便的。如有条件买瓶试试。

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Protector RNase Inhibitor? Roch的好像是。
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小荷尖尖[使用道具]
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我做了两个多月的半定量RT-PCR,用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时,怎么也得不到一致的量,是不是RT之后,用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理,驱除RNA,然后再测cDNA的浓度,再以相同的模板量进行PCR,就可以了?假如采用一步法,要定量的话,测完各个样品的RNA浓度后,以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了?
热切盼望哪位高手帮助!
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你的变性温度太高了,一般85~90就可以了,这样子很容易把DNA也同时扩增出现多条带!
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阿拉蕾[使用道具]
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我做了两个多月的半定量RT-PCR,用两步法做的。结果在用housekeeping gene调PCR模板量时,怎么也得不到一致的量,是不是RT之后,用RNase-H 将cDNA单链和RNA的杂交体进行处理,驱除RNA,然后再测cDNA的浓度,再以相同的模板量进行PCR,就可以了?假如采用一步法,要定量的话,测完各个样品的RNA浓度后,以相同的RNA量进行RT-PCR就可以了?
热切盼望哪位高手帮助!

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sorry i can not type chinese now.
it does not need RNase-H digestion,beside the single strand of cDNA is different. the Pcr procedure is changeable and not standerd in dfferent time. so u should do inner control every time and caculate the ratio of target gene and housekepping gene.
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大家好,我想请教各位,我的RNA抽提260/280在2.0左右,RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做,然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带(2.0%琼脂糖),是否为引物二聚体?可能是什么原因?CDNA合成失败?PCR条件不妥?我怎么检验CDNA的合成,紫外分光法,值是?希望大家赐教。xiexie。
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阿拉蕾[使用道具]
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大家好,我想请教各位,我的RNA抽提260/280在2.0左右,RT按MBI CDNA第一链合成试剂盒做,然后取十分之一PCR,可最常见的结果是跑出一条在溴酚兰前一点点的条带(2.0%琼脂糖),是否为引物二聚体?可能是什么原因?CDNA合成失败?PCR条件不妥?我怎么检验CDNA的合成,紫外分光法,值是?希望大家赐教。xiexie。  

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应该是引物二聚体。我在做实验的时候,也碰到这些情况。但我同时还得到我的目的带。检验cDNA第一链的合成,可以跑一下电泳,有一条从点样孔到溴酚兰之前的发散的光带。直接用紫外分光法测好象不准,因为同时还有RNA。RT的产物是单链CDNA和RNA的杂交体。
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