小中大一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的，实际上，半定量rt－pcr本身就是不可信的，大部分，我想，不过我做的是可信的，玩笑，^_^。因为我反复摸，每次作，重复做，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果，指的是基因表达结果，不是条带什么的。
不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，（我的可以，玩笑），3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 *** 帖过。
关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。
另：
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？
