PCR仪

我做的反转录***因长度有8.5KB左右，
我现在要做的其中一部分大约有6KB左右
抽提RNA用实验室其他人的引物经反转录扩增有条带
但是我自己的老是反转录不成功，
没有清晰条带，老是很模糊一带。
提高退火温度到60还是很模糊。不知道这里的高手有何建议
另外，反转录如此长的***因要注意什么，谢谢　

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个人认为,一般来说要扩增从反转录到PCR全过程的长达2kb以上的片断是相当困难的事,很多长基因是通过随机引物库得到的而不是通过oligo Td得到的,不要说反转录,即使是PCR也是很困难的,不信可以从质粒里试试,至于反转录,就更是天方也谈了,除了美的效率等,还有RNA的二级结构等因素,不知你的实验目的,可否从实验设计上修改.当然,霸王硬上弓未尝不可,这就要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了,roche和gibco(invitrogen)都有的.听天由命吧.另外,8.5真不多见,印象中知道的只有一个PTP是这样,不过还有那个著名的20kb的东东.

请问：
1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？
2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？
3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？

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一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.
20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.
如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

我准备从外周血中提取mRNA,然后做RT-PCR，希望扩增出特定的片段，
采用Gentra试剂盒提取RNA,提取完成跑电泳，正常人样品可见清楚两条带，而病人组要么只有一条带，要么什么也没有，不知是什么原因。
是RNA降解了吗？还是其它问题？（血样保存在-70度）

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要么事实如此,要么病人的标本问题,正明这一点在病人里做一个看家基因就行了.G是个什么试剂盒?

本人在作巢式RT-PCR时，常遇到空白对照（无模板）中也扩出阳性产物，请问这种污染可能来自何处，当如何处理？多谢！

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痕量的污染或者自无须有,巢式,嘿嘿,就是这样.亮不亮?多少个循环?是什么东西(阔的)?

我从国外文献查的引物，但没做出目的条带，如何确定引物的准确性？

==============================================================================================================在作之前连序列都没对过,就找着老外或者在外的老中去合成引物了?有种!一定要对一下,并且即使对了(指的是序列正确)也要看看它设计的好不好,不行自己来,呃都是推倒重来.
现在么,下载一个序列,在里面查一下不就行了.

本人在做RT-PCR遇到一怪现象，即本人对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）
从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！

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我想你可以考虑你另一组织的RNA是否有DNA污染。
建议将浓度较高的RNA稀释后再做反转录。