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标题:RT-PCR讨论区

椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-6 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最好在2管中；最好不用GAPDH；一般不用低温；最好是处理一下电泳槽。仅供参考，互相交流。
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Darcy[使用道具]
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发表于 2011-9-6 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教各位高人，我做一个细胞因子的RT-PCR,不同细胞系中均出现目的条带，但同时又有几根杂带，有的比目的带还亮，而同时做的对应已知阳性株却扩得很好，亮亮的一条带，很漂亮，尝试提高退火温度至65度，仍然没有改变，后将延伸时间从1分30秒降为一分钟，有的目的带又扩不出来。最后按标准程序做touch-down PCR,有的作的好，有的不好。奇怪，为什么不同摸版在同样条件下，扩同一个基因，会有这么大的差别？有什么办法可以提高反应的特异性吗？以下是我的一个RT-PCR的电泳图，请各位高人指教，谢谢。


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2011-9-6 17:35
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发表于 2011-9-6 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做wistar大鼠骨髓组织中TNF-α、IL-1β的western blot留取标本时是否需要把红细胞破坏掉?直接留取后放入液氮冷冻,深低温冰箱保存可以吗?
做骨髓组织中TNF-α、IL-1β RT-PCR是否需要提取除单个核细胞?直接破坏红细胞提总的RNA行吗?还有其他注意事项吗?

万分着急! 谢!  
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发表于 2011-9-6 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请把各个条带标记一下，另外阳性主是指表达很高的意思么？
第三泳道似乎很不错。
我觉得可能是引物的问题，在其它基因或者本基因上有相似序列，把基因的名字和序列传上来看看吧。
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发表于 2011-9-6 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
红细胞裂解不是很麻烦的事，分子克隆上似乎是有的，根据谁言要求，一般 的实验是需要去掉红细胞的。
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发表于 2011-9-6 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做RT--PCR可以用dUTP代替dTTP
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发表于 2011-9-6 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问
做RT--PCR可以用dUTP代替dTTP吗?
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-6 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
当然可以
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发表于 2011-9-6 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢
请问用TRIZOL从血清中提取丙肝RNA没有看到沉淀,结果也没有做出来是不是提取的问题啊,还有去除上清仍有少量可不可以烤一烤,温度是多少啊
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发表于 2011-9-6 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是一个新新手，现请教几个有关RT-PCR的问题：
1.组织半定量RT-PCR，RT时组织有无必要称重？
2.若测同一组织多种目的基因的相对表达，是否每种目的基因PCR时都要用内参对照？还是只作一次内参对照就行？内参对照是否必需要和目的片断的扩增同一条件？
3.20ul的PCR体系中需加入多少cDNA,我加的是5ul，可以更少吗？若减少加入量，PCR体系的其他成分的浓度需变否？
4.PCR反应产物是否要一定在48小时内电泳分析？以后再电泳图形是否就会不规则？长期保存在－20度是否仍会降解？
不知我表达清楚否？这虽是些很菜鸟的问题，可对我来讲也是很现实的问题，我也曾查过书，可仍是一知半解。望各位高手不吝赐教 !
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