【转帖】MTT实验两年心得 - 经验共享

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标题:【转帖】MTT实验两年心得

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发表于 2015-8-12 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

CCK-8目前的单空成本已经下降到每板1元左右，我听说的，我还没做过，所以不能给你提供详细信息。可以问问一些规模较大的细胞生物学试剂供应商
CCK-8这个化合物好像是日本人发明的，佩服日本人的敬业精神，这个化合物与MTT不一样（MTT检测是一次性的，测完后细胞就不存在了），检测过的细胞还是活的，换液后可以继续研究，这恐怕就是它的最大优势，当然要注意无菌操作。

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发表于 2015-8-12 15:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色。
我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就不对了，干扰了MTT的检测。

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发表于 2015-8-12 15:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MTT为淡黄色，用0.1 M的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了。不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，就可能导致MTT越不稳定。

ero11[使用道具]
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发表于 2015-8-12 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

辛苦搂主了，我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm,和您说的波长所测值会有很大差异马？

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发表于 2015-8-12 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性。570nm的吸收也是挺高的。波长不同吸光度会有差异，但不影响检测结果的趋势变化。如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射产生的），那么选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收所导致的误差。

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发表于 2015-8-12 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主辛苦了，我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？

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发表于 2015-8-12 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

单波长也是可以用的。双波长主要可以扣除非特异性吸收，比如细胞颗粒造成的吸收和板孔背景导致的非均一性吸收。如果使用96孔板前先检测板孔的背景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标记好不用，单波长也能大体扣除因此造成的非特异吸收。对于细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对结果判断的方向性不会有太大影响。
下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470 nm.