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标题:【转帖】MTT实验两年心得

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入的MTT不是说浓度5mg/ml吗？而且是20ul，你加入200ul怎么解释呢？请指教！
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发表于 2015-8-12 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
估计采用提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可能不可行。仅供参考，离由于如下：
我们常规加入的MTT是过量的，反应4h后96孔板的溶液仍是黄色，改变较小，这表明MTT加入的量的确是过量的。过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程，即酶已经被底物饱和。如果再增加底物浓度实际上也改变不了一定时间内的产物量。也就是说，底物再增加10倍，要想获得原先的吸光度，以前用3h，现在可能还是要用将近3h。因此意义较小。
当然，我用的是理论分析，应该以实验为依据。仅供你参考，如果能明显缩短反应时间那么还是很有意义的。
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发表于 2015-8-12 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做MTT检测药物对细胞的抑制作用也有一段时间了。在实验中我发现，在摸索出的有效浓度范围内设置梯度更小的药物浓度时，通常最低一两个浓度组的OD值往往会出现反弹（表现为比阴性对照组的值还高），个别情况下会出现中间组OD值也出现反弹，在这些异常情况时各组内的复孔值变化差异不大，可以排除是组内各孔的加样不均匀引起的异常变化。在操作中各浓度药物的加入也没有错误。请问有做过的同学也碰到过类似情况吗？可能会是什么原因？请知道的同学不吝赐教，谢谢。
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发表于 2015-8-12 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有个问题不明白，加入MTT后孵育3-4小时后要把培养皿中的上液移出吗？
这样做紫色的晶体不也会被移出吗？
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
移去的过程中要小心谨慎，尽量避免带出紫色结晶。如果是贴壁细胞还好，悬浮细胞的话，一般使用平板离心机进行离心后再去处上层液体。正是移去上层液体这一步不可避免的会损失结晶，所以也是造成MTT结果不稳定，且重复性差的原因之一。
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veiwu[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
加入的MTT不是说浓度5mg/ml吗？而且是20ul，你加入200ul怎么解释呢？请指教！

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是这样的，我配制母液是5mg/ml，使用时用PBS稀释10倍，然后加200ul，这样按大家所说，还是20ul。反应时间以前也做过，1h就足够。我当时做了MTT100ul＋2h，200ul＋2h、3h、4h，除了第一个条件OD略低，其他几个都没太大变化，尤其是200ul 3h和4h，数值是非常接近的。
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veiwu[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验结果已经出来。从结果来看，不去除培养基先加MTT和去除培养基加稀释的MTT相比，OD值的确有差别，前者要高一些。更容易淹没OD与细胞密度之间的线性关系。
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one[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下，在加MTT之前不吸弃原来的培养基（含有药物等处理因素），那么如果试验设定药物的处理时间比如是4小时，加了MTT再培养4小时，实际上药物就处理了8小时。这样得的数据是否准确呢？是不是在加MTT之前还是吸弃原来的培养基比较好？

[ 本帖最后由 one 于 2015-8-12 16:10 编辑 ]
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小游abc[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

又有问题了！我前两天做了两板！孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！结果很不好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？
问题2：由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很不准！有什么办法解决？
我们在Hanks液里加了牛血清白蛋白提高溶解度可行吗？不是说血清会影响结果吗？
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standup[使用道具]
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发表于 2015-8-12 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小游abc 于 2015-8-12 16:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

又有问题了！我前两天做了两板！孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！结果很不好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？
问题2：由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很不准 ...

1，注意细胞状态，细胞状态好的时候不会掉；或者倒液前离心。
2，药物可用DMSO溶解成母液，一般为使用浓度的0.1%左右，不过液有文献报道用1%，我看的文献有用1%、0.5%、0.1%的，尽可能要使工作液中DMSO的含量低，以免影响细胞生长状态。不要加蛋白促溶，一方面是否能起促溶作用不明确，另一方面蛋白可以吸附药物，尤其是小分子药物。
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