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标题:【求助】PCR 产物电泳拖尾严重

了了[使用道具]
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1
 

【求助】PCR 产物电泳拖尾严重


尊敬的各位:
您好!

请教一个问题:
我扩增的PCR产物电泳结果如图, 拖尾严重!!
唉!
请赐教!


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2015-8-29 16:06
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气泡[使用道具]
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实在是太夸张了~~~
能不能说明一下你扩的样以及条件?
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dior[使用道具]
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不知道你做的是单纯的PCR,还是RT-PCR:
如果是RT-PCR,可能是反转录酶失效或者活性不好了,mRNA没有完全转录成cDNA,mRNA跑出来不就是拖尾嘛?
看看是不是引物降解了,这样也会产生拖尾
其它的就是减少dNTP,提高退火温度,适当降低模板浓度,作个Mg2+梯度试试。
还有就是加点增强剂DMSO,据说有效,这个我没有试过
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园丁##[使用道具]
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模板量太多,提高退火温度
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panda王[使用道具]
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除了拖尾,你的目的带位置应该正确吧,那么PCR结果还不是太郁闷啊!关键是去掉非特异扩增。有以下几个建议供参考:
1.此次电泳明显上样量太多,可适当减少,易于观察。
2.你上样时一个泳道换一个枪头还是用一个枪头,如果是后者,尽量多吹吸几次,感觉好像有污染(不一定是)。
3.每个PCR体系中有蛋白污染的可能吗?因为有的泳道好像有东西没跑下来,由于蛋白和核酸的作用力可导致拖带。
4.PCR的退火温度适当可以提高一些以减少引物和模板的非特异结合。
5.减少PCR体系的模板量。
6.用热启动PCR试试。
7.体系中加些减少非特异结合的试剂。我们实验室用的是胶体金,效果很好。
另外,那个DMSO主要是阻止核酸形成二级结构的,如发卡等,如果PCR产物目的带前面距离很近的位置有较强的带,有可能是模板二级结构的影响,加DMSO可能消除,但我们做过,效果不是很好,目的带和其前面的带都变弱了,怀疑其抑制了酶的活性,反而加甜菜碱(作用同DMSO)的效果好。不过,看楼主的PCR产物这个问题可以先不考虑:)
祝你好运!
祝大家新年好心情!
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小鱼鱼[使用道具]
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是上海交大的吧?胡钧实验室发表了一篇很有影响的文章,也是关于用胶体金抑制pcr非特异性扩增的。
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了了[使用道具]
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尊敬的各位:
我首先感谢大家!
我采纳了大家的建议,作了如下调整:
1.  提高退火温度,由53℃提高到55℃;
2.  降低模板量。
第一次做,确实收到了效果,大家看看!进步很大。还算很好!
可是问题又有了。大家看我的下面一个帖子。条带没有了。
补充一下,我做的是普通的PCR,不是RT—PCR。


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了了[使用道具]
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但是,当我做第二次的时候,就成了这个样子,两侧的是Marker,大家看看。是怎么回事?我没有变什么条件呀?难道是电泳也和琼脂糖胶的问题??


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newway[使用道具]
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可以肯定的一点的是胶没倒好,因为Marker没跑好
其他问题暂时不好说
但最有可能的是:
这块胶太薄了,仔细看,胶的两侧有点儿东西,因为倒胶时,四周胶的厚度总是要比中央厚一点(物理现象),你上样时,样品还能呆在孔中,跑胶的时候,由于中间胶比较薄,DNA样品及一部分Marker就跑的电泳液里了,只有两侧Marker的一部分由于胶比较厚而留下。
不排除Loading Buffer没加好导致DNA样品扩散到电泳液中(可能性较小)
总之就是样品没进胶,不能说明你PCR的结果
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qqq111[使用道具]
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我估计是胶的问题,但主要的不是胶的问题,Marker没有跑好是胶的问题,但是你样品区根本就没有什么带,估计是你所用的试剂已经交叉污染了,建议你用一套新的试剂来试试。
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