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标题:【求助】PCR操作过程中有哪些注意事项?

铜雀[使用道具]
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【求助】PCR操作过程中有哪些注意事项?


请问各位高手,在PCR操作过程中应注意哪些问题?譬如做混合管时的加样顺序,吸取试剂前是否要混匀离心之类的。谢谢!
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www.1[使用道具]
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注意事项对会者来说不难,但是对新手来说应该还是挺多的,简单说几条:
1:避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。
2:引物设计要正确,选择可靠的生物公司合成引物,如果公司不好,给的引物会不出结果。据说上海生工不错。
3:DNA提取要成功。
4:引物和模板和体系所加的比例要合适,模板过量会抑制体系的反应。
5:跑胶时注意区分开EB污染区和清洁区。
6:吸取试剂前不必每次都混匀,离心是为了把粘在壁上和盖上的试剂离下来。不离也没关系,可以直接用枪头吸。
但是配制的时候需要充分混匀,比如溶解引物,需要先混匀再分装。
还有DNA提取之后最好4度过夜之后再做PCR,这有利于DNA的充分溶解。
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铜雀[使用道具]
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谢谢,很有用。还想问下,如果枪头上有残留打不出来会有影响吗?如何避免这个问题啊?
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铜雀[使用道具]
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还想问下,如果枪头上有残留打不出来会有影响吗?如何避免这个问题啊?
如果枪头有残留,当然会影响结果。首先可以考虑换好一点的进口枪头。其次,可以在加样的时候将枪头恰好伸入PCR反应管的液面下一点,然后将液体缓缓打入液面下,至恰好打出一个小气泡为至。
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铜雀[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 铜雀 于 2015-8-29 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还想问下,如果枪头上有残留打不出来会有影响吗?如何避免这个问题啊?
如果枪头有残留,当然会影响结果。首先可以考虑换好一点的进口枪头。其次,可以在加样的时候将枪头恰好伸入PCR反应管的液面下一点,然后将液体缓缓打入液面 ...

谢谢,估计换枪头是没有指望的,我试试看你后面教的方法吧!
还想问下模板放4摄氏度冰箱可以放多久啊?
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铜雀[使用道具]
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如果配好的引物没有完全溶解,吸取稀释后会有影响吗?
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purrr[使用道具]
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是融化吗?可能会有影响,一定要融化后再吸取稀释
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www.1[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 purrr 于 2015-8-29 17:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是融化吗?可能会有影响,一定要融化后再吸取稀释

我做过的许多次PCR中,不完全溶解是不影响结果的。
不管是buffer还是taq还是引物,
每次我都是看溶够了我用的量就开始吸。
一来能有效保护产品的质量。
二来节约时间。
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remonte[使用道具]
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没试过不完全溶解到底行不行,每次我都害怕结果不好而全溶。
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remonte[使用道具]
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用枪时候一定要按到底吗?我就不全是这样,比如加电泳样品的时候,全打出来反而把气泡也打出来了,只要刚好把样品全打进去即可。不同情况用枪习惯也不同,看情况而定。灵活。。。。。
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