小中大【讨论帖】引物设计中可能被忽略的几个细节
最近PCR做的比较多，像启动子克隆，RT-PCR，BSP,MSP都做过，引物多数由自己设计，稍有一些心得。下面就引物设计中一些可能被大家忽视的细节发表一些愚见。
1. 引物的GT含量对形成引物二聚体有很大影响。
我们一般会认为，引物形成二聚体是因为引物自身形成发夹结构，或者引物间形成dimer或cross dimer。事实上并不仅仅如此。我曾经用数十种引物跑过电泳，发现条带间的亮度差别很大。分析了各条引物的发夹结构及dimer的形成能力，发现并不与条带亮度正相关。后来通过各种碱基含量分析，得出一个结论，GT含量高的，特别是G含量高的，电泳时往往会得到较亮的条带。这给我们一个提示：引物设计时，要想避免PCR产物中出现引物二聚体，应选择AC含量高的引物。
2. 引物的退火温度和GC含量并不是严格正相关。
我们设计引物时往往会选择让两条引物具有相同的GC含量。但实际上，相同GC百分比的相同长度引物，退火温度可能相差5度以上。退火温度是由引物与模板结合的稳定程度来决定的，但这种稳定程度除与GC含量相关外，还与碱基排列顺序有关。这是因为，双螺旋中，每个碱基对的两个碱基并不是一直处于同一平面，这与碱基对及碱基排列顺序有关，而这种双螺旋的构象影响了引物结合的稳定性。
3. 设计引物时，应尽量使引物5‘端稳定，3’端不稳定
3‘端的稳定性对引物特异性至关重要，这是众所周知的。而不稳定的3’端会使错误配对的3‘端变得极不稳定。同时，5’端的稳定性可以保证引物与模板的紧密结合。
