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标题:【求助】我提的RNA能做RT吗？

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发表于 2015-8-31 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我提的RNA能做RT吗？


各位好
请教一个问题,我提总RNA后，跑琼脂糖电泳，未经变性处理。可是看来似乎不是特别好。请大家帮我看看这RNA，能做RT吗？？特别是6号带，那可是我自己的血分离的单个核细胞啊。
谢谢


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2015-8-31 15:35
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remenb[使用道具]
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发表于 2015-8-31 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为你没有必要跑RNA的电泳 你可以用分光光度计检测RNA的含量和纯度 再来决定是否能作cDNA及PCR。电泳容易降解RNA。
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发表于 2015-8-31 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该能做。不管rna多少都能做。
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发表于 2015-8-31 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以，做northern不大好，但rt可以，难以保证肯定成功
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发表于 2015-8-31 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 remenb 于 2015-8-31 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我认为你没有必要跑RNA的电泳 你可以用分光光度计检测RNA的含量和纯度 再来决定是否能作cDNA及PCR。电泳容易降解RNA。

这位仁兄的看法我不赞同。判断RNA质量如何要从以下二点考虑：
1 测含量和 OD260/OD280 判断蛋白是否污染的严重。
2 电泳 ，我认为这是最重要的指标，一是看28S,18S的比例对不对，二是看RNA有没有降解，三是看DNA污染的情况。
RNA是否可用，要看是什么用途，如果只是为了克隆某个基因，那要求可以低些，以上RNA图可用。如果是为了做半定量PCR或定量PCR，那还是要讲究些。
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发表于 2015-8-31 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得就新手来说，还是应该跑跑电泳，毕竟RT-PCR涉及多步骤，万一无结果，如果我知道RNA的量和纯度都是好的，电泳也没降解，那么就是逆转录或是PCR体系的问题，这样既可以节省试剂又可以节约时间。至于电泳，虽说按教科书上应作变性电泳，但对像我这样的非专业的“实验员“
，普通琼脂糖的效果就不错，28S与18S的比例还是能看得很清楚，就我的一点经验看，跑电泳时加RNA的量不要太多，时间不要太长，只要都跑出空就可以了。楼主的电泳一定跑了不短的吧，恐怕RNA有降解了吧，还有1，3孔里好像还有东东，是不是DNA污染？不知楼主的RNA纯度怎样，要是没问题的话，我觉得作RT应该是可以的。
本来想贴张我跑的RNA电泳图，可惜图有点大，又没有图片编辑软件，不太会用贴‘图功能，只好算了。祝楼主好运Smile
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发表于 2015-8-31 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

理论上，迹量的RNA都可以得到扩增。从你的电泳图来看，应该可以扩增。而且做RT-PCR前，不需做电泳。用微量紫外分光光度计，可以检测含量和纯度。
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发表于 2015-8-31 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从该图看,28S和18S均清晰,RNA的质量应该是可以的对于提取的RNA一般需要鉴定质量和纯度这是必须的,虽然电泳比较烦琐
1.紫外分光光度计下记录,OD260/280比值,如果在1.6-1.8,说明RNA质量可以,同时可以对RNA定量,知道提取到的RNA量,这对于进行定量分析很重要
2.此外还需要通过电泳鉴定RNA的完整性,分子克隆推荐的方法是1%甲醛变形琼脂糖凝胶电泳,若28S和18S清楚,比值为2:1,则表示RNA完整,降解的RNA电泳中28S和18S条带消失,且主要的片段集中在18S的前方.在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下
3.在下面的鉴定就是你的RT-PCR了,如果扩增阳性,那就不用担心拉.
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shkudo[使用道具]
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发表于 2015-8-31 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在这里推荐一种简单的RNA电泳鉴定法,采用1*TAE的1%普通琼脂糖电泳效果也很好,只要不是做NORTHERN,可以省却许多麻烦,有兴趣的可以试一下

============================================================

胶里什么其他的东西都不加吗？这样不担心RNA会降解吗？请指教。
如果这样真有效果我倒想试一试。
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shkudo[使用道具]
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发表于 2015-8-31 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想你可以考虑一下再次提纯，纯化出纯度高的MRAN，你看呢，再见
pengjun82yahoo.com.cn
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