小中大首先一定要坚信一点,那就是核酸一定会与装它的容器的接触面发生反应,达到某种均衡。EP管的材质,首先可能吸附核酸,其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化,如变性。在核酸的浓度比较高时,这个现象可能观察不到;当核酸浓度很低时,则比较明显了。在低浓度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以稳定核酸,虽然已经为实验所证明,但许多实验人员并没有将该建议当回事。 现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料,在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP材质要好许多,但其化学特征,尤其是对核酸稳定性的可能影响,远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要求一样,其负面产物可能是,抽提的质粒电泳的构型越来越多:除了原来的三种带型外,还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。 8:核酸质量的检测问题 将抽提好的核酸直接用于后续的实验,是唯一可靠的检测方法;除此之外的检测方法,都是相对的,而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方法,一是电泳,二是紫外分光光度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小,只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围),该方法还是非常可信的;电泳还可以用于估计核酸的浓度,但其准确度与经验有关;另外,电泳也可能提供某些杂质污染的信息,但是同样与经验有关。紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量,然而,由于紫外分光光度仪不能确保非常准确,而该仪器的灵敏度又非常高,所以,提供的结果并不十分可信。一般讲,同时进行紫外和电泳检测,综合二者的结果,可以做出一个更合理的判断。但由于这两个方法都有缺陷,所以,即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验,也不用大惊小怪。 关于紫外分光光度仪的检测。首先,不要使用不能选择波长的仪器;使用那些已经固定了波长的仪器,大概可以算是你梦魇的开始。(没有信息是可怕的,更可怕的是将错误的信息当真。)其次,一定要经常调较仪器;调较可以使用非常纯的自备核酸,也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法,非常简单;具体道理可以见我以前的帖。)最后,要记住读数 A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1为理论上的数据,实际测定时会有一些差别;但如果差别太大,就有问题了。有两个值得商榷的观点:如果 A260/A230 > 2就是纯的,如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大许多,一定是有杂质残留的(具体是什么杂质我不知道)。如果核酸抽提好后立即就测定,A260/A280 > 2.3 决不提示核酸降解,原因是:那些能导致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小,常规的沉淀是不可能将它们沉淀下来的;更可能的原因是:你仪器提供的 A260/A280实际是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。纯的核酸的吸光值,在 A230 是谷底,在 A260 是峰顶,在 A280则正好是半山坡。根据曲线在底和顶的斜率最小,在半山坡的斜率最大的特点,不难得出如下结论:A230 和 A260的读数受仪器准确性的影响比较小,而 A280 受仪器准确性的影响比较大。 建议先电泳检测,再用紫外分光光度仪检测。电泳后,可以看到哪些样品根本就不能用 (如降解太厉害),以及核酸的大致浓度,这样就为紫外分光光度仪的检测提供了一个参考 (降解的不必要测了,要测的该取多少量等)。 9:问题解答 A 抽提过程中的现象及可能的原因 I:核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。)。75%乙醇洗涤后,如果是空气干燥,几乎不可能过分干燥的,尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验:撕取少量 Merck 的丝状CT DNA到一个离心管中,加入无水乙醇;10 分钟后彻底去除乙醇;待乙醇完全挥发后,加入 TE,10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。 II:使用异丙醇沉淀核酸,沉淀为白色 – 多糖残留。 III:核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留。 IV:75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时,沉淀变大了 – 见 10-III。 B 紫外检测 I:A260/A280 比值低 – 蛋白质残留。但如果操作过程中使用了苯酚,则更可能是苯酚残留。 II:A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差 – 苯酚残留。 C 电泳中的现象及可能的原因 I:加样孔有荧光 – 首先一定有 DNA 的滞留;其次多含蛋白质残留;如果是比较特殊的样品,其杂质也可能导致荧光。蛋白质几乎不会被 EB染色,能出现荧光,则一定含有核酸。非常巨大的基因组DNA (>50kb),如果使用普通的琼脂糖电泳,往往不能电泳出孔,单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。更多的时候,是比较大的 DNA与残留的蛋白质结合后,电泳不能出孔
而在孔中产生荧光。酶反应产物,如果没有经过纯化去除酶,也非常容易在孔中出现荧光,其原因是酶与核酸几乎都有比较强的结合能力 (基因组 DNA 的PCR产物电泳往往在孔中都有荧光,而且荧光强度与体系的特异性成反比。)。如果是植物样品,还可能由其它杂质残留引起。我的经验是:蛋白残留的荧光有点发闷,其它杂质残留亮得很刺眼,且薄得锐利。 II:总 RNA 非变性电泳显示过多的条带 – 根本就不是问题。 III:总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮,但条带清晰无弥散 – 多提示 28S 没有被 EB 饱和。RNA 残留多时,基因组 DNA 的电泳也会有相似现象。简单的补染可以解决此问题。再次电泳时,或者降低上样量,或者增加胶中 EB 的量。 D 降解的现象、原因及对策 降解的现象,如果抛开问题电泳所致,可以简单总结如下:主带不再突出,向小片段方向发生弥散,亮度比较均衡地衰减。