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标题:【求助】抗凝血DNA的提取

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发表于 2015-8-31 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大侠，能否传个Protocal上来呀？我们老师非让用自己配的试剂提取，不让用试剂盒，用不用提取前对血进行WBC的分离处理？小妹在等！！
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发表于 2015-8-31 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Protocal
1. 分离外周血白细胞
(1)取患者肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10 min。
(2)小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
(3)在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15 min。
(4)2500rpm离心10 min，弃上清。
(5)加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15 min。
Devil3000rpm离心10 min，弃上清。
(7)倒置离心管，去掉残液。
Musical Note得白细胞，－80ºC冻存。
2. 从白细胞中提取基因组DNA  
(1)取白细胞，加4.5ml SE，使劲吹打，混匀。
(2)沿管壁加入0.5ml的10％SDS。
(3)加蛋白酶E 50μl／管。
(4)首尾轻摇10 min，混匀。
(5)37ºC水浴过夜。
Devil第二天取出，沿管壁加3 ml饱和NaCL，迅速手摇15秒，使蛋白变性析出。
(7)4000rpm离心10 min。
Musical Note取出上清，放于另一管中，加入等体积的三氯甲烷，混匀15 min。
(9)2500rpm离心10 min。
(10)取出上清，加入等体积的三氯甲烷，混匀10 min。
(11)2500rpm离心10 min。
(12)取上清，转入50ml管中，加3倍体积无水乙醇。
(13)首尾轻摇，见DNA絮状沉淀析出。
(14)将DNA挑至管壁，75％乙醇洗涤2遍。
(15)将DNA挑至0.5ml管中，冻干。
(16)加TE 300μl，使DNA溶解，4ºC保存。
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发表于 2015-8-31 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. DNA提取用试剂
灭菌双蒸水(ddH2O)
0.1M HCL: 10M HCL1ml加99mlddH2O。
0.1M Tris: 1.21gTris加ddH2O溶解定容至100ml。
0.1M Tris- HCL(pH8.0): 0.1M HCL58.4ml加0.11M Tris碱100ml。
0.5M EDTA(pH8.0)： 称取186.1g Na2EDTA.2H2O, 用700mlddH2O溶解,用10M NaOH调校至pH8.0(50 ml)。
低渗溶血液： 氯化铵7.01g,碳酸氢钾0.07g,加ddH2O定容至1000ml。
SE: 醋酸钠1.36g,氯化钠4.38g, 用400mlddH2O溶解, 冰醋酸调pH至5.6, 定容至500ml。
蛋白酶E: 10 mg/ml
TE: 1M Tris- HCL(pH8.0)1ml, 0.5M EDTA(pH8.0)0.02 ml, 加ddH2O至100ml。
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发表于 2015-8-31 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上面方法简单、省钱
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发表于 2015-8-31 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看很多书上说用ACD抗凝更好，不知道是不是这样呢？
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发表于 2015-8-31 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有问个比较菜的问题，EDTA抗凝用的是干粉吗？和血液的体积之间需要什么比值关系吗？
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kewanqi2011[使用道具]
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 小中大
还有问个比较菜的问题，EDTA抗凝用的是干粉吗？和血液的体积之间需要什么比值关系吗？
当然不是用干粉，配成0.5MOL/L的浓度，一般我抽5ml血，加65ul的EDTA，但要混匀，个别还是有凝血，但EDTA又不能加的太多，否则影响DNA的提取
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发表于 2015-8-31 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

EDTA抗凝用2.5%的溶液，与血液之间体积比一般是1:10
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发表于 2015-8-31 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果用陈血用试剂盒提取DNA，第一步请一定用三蒸水裂解红细胞两到三次，新鲜血不用，后面的就可以按照步骤做，这样效果会好一点。
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发表于 2015-8-31 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
DNA的提取和纯化
1 DNA提取
⑴ 新鲜外周静脉血3~5ml，以ACD（柠檬酸纳缓冲液）1/7体积抗凝；
⑵ 3500rpm 15分钟离心，吸除上层血浆；
⑶ 加5倍体积蒸馏水（灭菌），摇匀，静置5~10分钟，3500rpm15分钟离心，去上清，（若沉淀不够，可重复1~2次）；
⑷ 吸取沉淀（少许液体）放入1.5ml离心管，STE 清洗2次；12000rpm 7~8分钟离心；
⑸ 去上清后加0.5mlSTE，10%SDS 25~30ml，蛋白酶-K 5μl（100μg/ml）37℃消化过夜，直至沉淀物溶解为止；
⑹ 等体积饱和酚，倒转摇匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；勿吸入蛋白层；
⑺ 上清液加等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：10），倒转混匀10分钟。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；
⑻ 上清液加等体积氯仿：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上清入另一管；
⑼ 加1/12体积3M 醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃无水乙醇，轻柔振摇；应出现白色絮状物（DNA）；于-20℃放置20~30分钟，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，沉淀DNA，去上清；
⑽ 加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，去上清，重复1次；
⑾ 自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃备用。
2 DNA浓度的测定取15ul DNA  标本加1485μl 双蒸水，充分混匀后，用紫外分光光度计测定波长分别为260nm、280nm、330nm时的OD值，计为OD260、OD280、OD330，计算浓度和比值，判断DNA的浓度和纯度。
DNA浓度（μg/ml）=（OD260-OD330）×50μg/ml×稀释倍数（100）
DNA纯度=（OD260-OD330）/（OD280-OD330）
若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高，用氯仿抽提纯化。
3 DNA的纯化
⑴ 加等体积氯仿；异戊醇，轻轻振摇5分钟，12000rpm低温离心5分钟，吸取上层水相至另一EP管；重复一次；
⑵ 加入1/12体积的3M NaAC，混匀，再加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA；12000rpm低温离心5分钟，去除上清；
⑶ 加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温离心10分钟，去上清；重复1次；
⑷ 真空干燥，加适量TE溶解，置4℃备用。
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