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标题:【求助】做PCR时枪每天用,但是不知道怎么用才最好？

PCR[使用道具]
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发表于 2015-9-1 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做PCR时枪每天用,但是不知道怎么用才最好？

大家好,我现在每天都在做PCR,每天也都在用枪,可是不知道怎么用枪才是最准确的,为了取样准确,为了防止枪的污染.
1:我在取样的时候总是发现枪头外有液体,这样就会不准了,不知道怎么很好的避免?
2:在PCR取样操作时,一般都是小于5ul的液体,是不是一定要靠着PCR管壁打的?是沾着下面的液体还是不沾着打呢?我总是感觉不沾混合液着吐液体时,管壁上总是东一滴西一滴的液体,而沾着混合液着吐液体时又有很多气泡,不知道各位有什么好的建议?
都是些小问题,但是我觉得都比较重要.谢谢各位了.
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pou[使用道具]
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发表于 2015-9-1 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.楼主不会一次就作一管吧？我一般都是2-3管，多了更好，可一起加，在分加不同的引物或模板
2.我的经验,PCR技术相当成熟了，多少一点影响不大.
3.有耐心，眼睛看仔细(呵呵，这是最重要的)
4.Effendorf的2ul枪经典，我的最爱啊！
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-9-1 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚开始做PCR的时候也是有这样的疑问，不过我们实验室的经验是：用枪往外滴加试剂的时候，不要让枪头碰管壁，而是让打出来的液滴去碰管壁，一碰它就贴到管壁上了，像你说的东一滴西一滴的问题我们也存在，稍微离下心就好了。没有问题的。
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发表于 2015-9-1 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

作PCR时 可以预先配好 包括引物、buffer、dH2O、盐类在内的MIX，可以很大程度上减少误差，而一些酶类由于保存在粘性的甘油里，所以吸取起来比较费时，我一般是最后加入Taq酶，缓慢吸取，然后把枪头深入反应体系的液面以下，反复的吸放几次，最后在把枪头内的液体打净，这个过程中可以看到甘油在进入体系时形成的液体流，这样就比较放心了，站在壁上的液滴用手甩一下基本也可以落下了！
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 小中大

吸取液体时，枪头不能浸入液面太深，一般2ul的枪浸入约1毫米左右，因为浸入过深，液压会对吸液的精确度产生一定的影响，而且沾上液体的可能也变大。吸取时平稳松按钮，不要太快。
放液时，吸头紧贴管壁，先将按钮按至第一个停点，稍作停顿，再按至第二停点，这样可确保吸头内无残留液体。若是吸头内仍有残液，应考虑换吸头。最好每吸一次，换一个枪头，主要是第二次吸时不一定准，也不一定能完全打出。
另外，为保证枪的准确度，枪的维护和校正也很重要，比如枪用完之后要调到最大量程位置，防止弹簧失去弹性。
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发表于 2015-9-1 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做PCR时，一般不要做的样品太少，因为这样加液体时量比较少，如果沾到壁上，对整个实验影响都比较大，通常将buffer、dNTP、镁离子、Taq酶配成稍多样的混合液，这一点就不说了，我想大家都有这方面的经验。
我想说的一点就是我在用移液枪吸取液体时，一般不要将枪头伸入到液面以下过深，一般1～2mm的样子，如果浸入液面过深了，再拿出枪头时动作一定要缓慢，这样一般沾在枪头外面的液体比较少；滴加液体时，我的经验真的很实用，那就是将枪头慢慢浸入到液面以下，也不要太深，然后根据情况慢慢抽打几次，将枪头内壁上的残留液体尽可能稀释，然后慢慢将枪取出液面，在距离液面有1mm的地方，将液体打下，你会发现枪头里面的液体全部被离心管里面的液体吸下去了，而且十分干净。
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zhezhe[使用道具]
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 小中大
呵呵，楼上几位说的都很好！
我也来说说我的经验！
我想说的第一点就是，你的枪一定要和你的枪头相配。我们这里有100ul的枪和我们的黄色枪头很不匹配，每次吸上液体的时候，最往下打的时候，总在里面残留液体，使劲往下打，它反而道洗的更多，然而当200ul的枪和黄枪头匹配的时候，就不存在这种现象，每次都很干净。
还有一点就是，我的体会就是能用大枪头就用大枪头配反应液，我感觉就是互相污染的可能性也小，虽然每次感觉损失很多，但是比起污染的结果，我觉得这应该是可以接受的。
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dior[使用道具]
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 小中大

我发现目前国内实验室用的大部分是国产枪头，也许是生产工艺的问题，很多枪头并不是跟枪匹配，如果留有空隙的话可能加入的样品准确度就不行了。我一般都是有自己熟悉的枪，吸液的时候要轻轻松手释放活塞，吸其后根据经验判断一下吸起的体积是否准确，然后再轻轻加在PCR底部，加液的时候没有必要来回吸取混匀。实验室的枪用的人很多，加上缺乏维护和检测，体积不准常有的事。加样时为了避免污染和错加漏加，将已加入的管和未加入的管分开摆放，盖上阳性对照管后再给其他管加入模板。为了防止污染，我都有做PCR专用的枪头。
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dior[使用道具]
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 小中大

做了几乎快一年的PCR了,最多的一天做快300个标本了,其实加样没有必要非那么准啊,如果你想准的话最好要保证你的加样枪是准的,另外你的吸头不沾液体,最好用进口的耗材,包括吸头和PCR管,当然为了省钱,就只能用国产的了,很多国产的没有法用,尤其是PCR管,盖子很难盖住,打开还不容易,另外国产的PCR管弹性很好,当你没有盖好后,一不小心就弹出去很远,把里面 的液体都给弹出去了,很郁闷,不知道大家有没有体会.在前面的条件保证的情况下,那么怎么吸,就很重要了,需要吸的体积最好要和你的加样枪匹配,如你要吸的是2ul的体积,那么你最好用0.1-2ul或者是0.5-10ul的,最好不用2-20ul的.我说的就是这个意思,最好要匹配.还有就是比如你一次要做几个,十几个或者几十个到上百个样品,那么你最好把能混到一起加的都混到一起加,这样既可以保证各种成分混的比较均匀,还可以省时,省很多吸头,还可以保证加样的准确性,为了防止分装时体积不够,最好多加点BUFFER和无菌ddH20,但是要按比例加．尤其是加酶的时候，要注意吸头不要伸的很深，要刚进去液体中一点但可以吸到正好，如果吸头进去的太长会带出很多酶，这样造成不必要的浪费（尤其是有些酶很贵）和ＰＣＲ效果的不理想．前面的战友已经说到，吸取液体的时候要慢慢放，不要放的太快，否则会造成吸样不准或者液体被吸到加样枪中，有些液体会对枪造成腐蚀，时间长的话也可以造成堵塞．
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HP007[使用道具]
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 小中大
做分子生物学的实验也有一段时间了，我也说说个人经验，希望对大家有帮助：
1、枪头外有液体，两个原因：一个是枪头伸进液面太多导致液体粘在枪头上；另一个原因是国产枪头几乎都有这样的通病，枪头的材料或者是制作工艺的差别，枪头的抛光度不够而导致液体容易粘在枪头上。
2、加样时特别是加少量样品时，最好是沾着下面的液体打。具体做法是将枪头伸进液面少许，打出样品。为了避免出现气泡，当把最后的一点样品打出来后会出现一个气泡，这个时候缓慢把枪头移出液面，这时气泡会跟着上来，当枪头离开液面时气泡也会跟着破裂。如果要用枪头打匀样品，不用每次都打到最大量程，一旦打最大量程很可能就会出现气泡，可以只按部分多打几次就可以了，最后一次再打最大量程把枪头的样品打干净就可以了。如果加样后管壁留有少量样品，可以通过短暂离心的方法离下去。
祝各位战友实验顺利
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