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标题:【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了?

爱老虎游tt[使用道具]
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我们并非采用不对称PCR方法,而是经典方法,体系配制错误造成不对称PCR的可能性比较小(多次重复的结果)。之前未能提供实验细节,对不起各位。我将尽快发上具体实验条件(师姐的实验,我是助手)。
不过即使是不对称PCR,酶切结果似乎也不改如图2那样。因为它基本符合我们的预期结果,没有多余的条带。
另外还想请教,单链是否能被酶切?
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爱老虎游tt[使用道具]
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相关疾病:
先天性卵巢发育不全综合征
实验目的:检测目的基因单核苷酸多态性S/X
体系配制:10×PCR Buffer  2.50
10mM dNTPs   0.40
Taq DNA聚合酶(2U/ ) 0.40
正向引物(25uM) 0.4
反向引物(25u M) 0.4
ddH2O   19.60
模板(100ng/ ) 2.00
总体积  25.00
PCR条件
94 C 变性 5min;
94 C 60s,60 C 30s,72 C 45s 共35个循环;
72 C 延伸 2min;
预期PCR产物为488bp
酶切反应
经MnlI限制性内切酶消化后,SS基因型在胶图中有两个片断(285bp和203bp),SX基因型有三个片断(285bp、248bp和203bp),XX基因型有两个片断(248bp和203bp)
电泳条件
3%琼脂糖凝胶,110V,1小时20分钟,大的水平电泳槽,正负电极间距离有24cm
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chengjie79[使用道具]
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我就是那位师姐。谢谢各位的热情帮助。希望这个问题能早日解决。
另外,我发现国外发表的一篇论文(也是做这个基因的同一位点的多态性)的PCR产物电泳结果和我是一样的,也有条很靠近的条带,而酶切结果也是不出现此条带。
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feiya[使用道具]
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个人意见:
战友可以考虑提供该国外论文的原文,给各位战友参考
也可以考虑直接email 给该论文作者,询问论文作者对这个问题的解释。
欢迎大家集思广益,继续讨论~
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72度停留5-10分钟,竟然可以延伸出polyT,而且还有几十个之多,我以前没有见过相关的资料,不知如何得到的这样的结论的?
一般的资料显示,停留这步主要还是保证产物的完整性,另外还会加A(TA克隆的依据)。
yes,我搞错了,72度8min的目的是为了加上polyA吧,我随手写成了polyT,但是这个现象确实是我遇到过,而且不止一次,在PCR完成后不进行72度这一步,确实会出现2条带,大小相隔很近。
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shkudo[使用道具]
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不是polyA,一般只能加一个,加两个的概率要低好几个数量级!
另外,同意版主的意见,把原文传上来,大家一起分析,毕竟很多人没有遇到过这样的情况!
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长见识了,看来我对我实验出现双带的理解一直是错误的,72度处理8min原来一般只能加上1到2个碱基A,之前一直想当然了,呵呵!3q。
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am10[使用道具]
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我做PCR实验时也会经常遇到这种情况,我认为这是引物的不特异,也就是说该引物可以扩增出除目的带以外的其他带,但是,你的酶切位点只存在于目的带上,所以酶切后是正常的。
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jude[使用道具]
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会不会是有多个拷贝?拷贝之间差异很小,酶切结果一致?
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爱老虎游tt[使用道具]
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……那么非特异性扩增产物哪去了?为什么酶切后的电泳见不到它们?
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