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标题:【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了?

爱老虎游tt[使用道具]
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今天听到一种新的解释:很接近的两条带可能是DNA的不同螺旋状态,分子量一样,但是由于螺旋的状态不同,泳动速度不同。
松弛DNA在 拓扑异构酶或者溴乙锭 的作用下可以变为正超螺旋,而超螺旋结构在电泳过程中涌动速度快于线形DNA(也就是松弛DNA)
一同学说PCR时碰到过同样的现象,其师姐说属于正常现象。
越看越觉得有道理,呵呵
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junhun[使用道具]
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相关疾病:

不会本身引物特异性不好,批了同源序列吧。。。螺旋状态。。那是瞎扯淡。。你又没环化。。何来螺旋。。当然除了双螺旋结构。。同学和师姐。。都是瞎扯淡。。。
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veiwu[使用道具]
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以前参加讨论的一个关于STR的帖子也有这个问题,最后也没搞清楚是啥,还为了当事人不求甚解而叹气。难得这两位师姐弟这么有求知欲,都准备去测序了,先赞一个,搞科研就应该这样精益求精!
个人意见:每对带的亮度比似乎较稳定,说明两者很可能是同一片段衍生出来的不同形式,而且这种变化不是百分之百,而是按比例的。这里有几十bp的长度差,首先排除末端加A;成环和不同螺旋状态倒是有可能,但按一定比例发生这样的变化而不是全部变,似乎需要更多热力学上的证据;变性不完全和同源序列也有可能,但似乎错误低级了点,不太容易犯。
嘿嘿,说了半天,我没啥新idea。还是等你们测序结果吧。一定要会来通报啊。
Btw,北京很多地方有测序服务,不过你的量肯定少,不知道有没人愿意做。我有朋友也做这个,我可以帮你问一下,需要的话给我email。
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redbutterfly[使用道具]
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那我提个问题:很接近的两条带可能是DNA的不同螺旋状态,分子量一样,但是由于螺旋的状态不同,泳动速度不同。
松弛DNA在 拓扑异构酶或者溴乙锭 的作用下可以变为正超螺旋,而超螺旋结构在电泳过程中涌动速度快于线形DNA(也就是松弛DNA)
一同学说PCR时碰到过同样的现象
如果是如此解释,为什么平时PCR很少发现这种现象,而你们这种PCR发生的几率这么大?
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dog002[使用道具]
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我有过相似经历,我来尝试解答!
根据图片,大带应为期望的488bp产物带;小带(看起来好像小了20-30bp左右)可能是由于核酸的二级结构造成的。
前提是该基因在基因组内可能是多拷贝的。有的拷贝可能存在1个或几个小片段的缺失。在PCR过程中就会形成如示意图中的产物(有两个小片段缺失)。该种结构在琼脂糖上会形成如楼主图中的小带。当然,由于酶切后,片断变小,这种影响就小了,自然就看不到双带的现象了。
根据我的经验,楼主可以将同样的PCR产物在聚丙烯酰胺胶上跑一下。如果我猜得没有错的话,其结果很可能就是小带消失了,取而代之的是一条比真实产物还要大很多的带。这主要是由于形成二级结构的产物在聚丙烯酰胺胶上前进更为困难所致(胶孔比琼脂糖小很多)。
可能有人会问,为什么有缺失的拷贝的自身的PCR产物没有形成额外的带。答案就是,缺失的碱基数很少且琼脂糖的分辨率有限,所以无缺失的和有缺失的PCR产物都在那条大带里,而只有形成如示意图所示的二级结构的产物时,由于其泳动能力特殊,所以才会出现小带现象。
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爱老虎游tt[使用道具]
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我想可能跟我们的片段长度比较长有关系吧,将近500bp,而酶切以后不再出现是因为片段长度短了,当然这只是我的猜想。
我特意问过那位见过类似结果的同学,她说当时P的片段也比较长。不过她的实验似乎不做酶切。
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redbutterfly[使用道具]
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楼上师兄,我问一下,有一次,我做RT-PCR时,用actin调整模板浓度,每隔3个循环拿出来检测一下,25个循环拿出来检测时有两条带,28个循环再检测时就剩一条带了,这怎么解释呢?
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baidukk[使用道具]
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今天听到一种新的解释:很接近的两条带可能是DNA的不同螺旋状态,分子量一样,但是由于螺旋的状态不同,泳动速度不同。
松弛DNA在 拓扑异构酶或者溴乙锭 的作用下可以变为正超螺旋,而超螺旋结构在电泳过程中涌动速度快于线形DNA(也就是松弛DNA)
一同学说PCR时碰到过同样的现象,其师姐说属于正常现象。
越看越觉得有道理,呵呵
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这种情况只在质粒提取后跑胶遇到过,超螺旋、螺旋和线性会有不同的带,但是在PCR后跑胶也出现不同形态没有遇到过。
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xyw5[使用道具]
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蛮有道理,不知是否做过验证?
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爱老虎游tt[使用道具]
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这种情况只在质粒提取后跑胶遇到过,超螺旋、螺旋和线性会有不同的带,但是在PCR后跑胶也出现不同形态没有遇到过。

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想起来了,那个同学就是做的质粒
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