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标题:【求助】PCR产物电泳条带为什么被“劈开”了？

feiya[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的SSR，其中一对引物扩增出的产物和楼主情况相似，也曾按照楼上说的做过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，但结果是一样的，出现上下两对一模一样的条带，还有一个师姐，她做的乌贼，也出现了这种情况，不知大家有什么好的见解？
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爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

简单重复序列出现“影子带”的问题似乎很常见啊。我碰到问题之后看过一些关于简单重复序列出现影子带的文献，机制不是特别清楚，但“滑动”理论似乎比较受到认同。也有一些解决办法，似乎都不是很彻底。
看看这篇文献？《二核苷酸微卫星PCR扩增的影子带及其来源》
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我来出示一些实验证据：
首先是琼脂糖图片，我扩增的是ITS片段，该片段在基因组内是高度重复的。仔细观察图片，可以看到除9，10号个体外，其他个体的PCR产物都有前托尾现象，其原因如上所述。9，10号个体未见前托尾现象的原因是这两个个体是纯合子，即所有拷贝的序列是一致的（经过测序验证）。之所以是前托尾而不是形成如楼主的图片中的条带是因为个体基因组内ITS片段杂合度（这里的杂合度是针对碱基缺失而言）较高，不同的拷贝间会在PCR扩增过程中形成多种多样的二级结构产物。


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发表于 2015-9-1 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

聚丙烯酰胺图片：
A,B,C为ITS片段克隆后单菌落PCR结果，符合真实产物片断大小。
D: A与B的PCR产物的混合物，经过变形复性后，上样 （单带）
E,F,G: A与C的PCR产物的混合物，经过变形复性后，上样 （双带）
测序结果证实，A与B序列完全一致，A与C仅差3个左右的碱基，却造成了如图中比正常产物大许多的条带。


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发表于 2015-9-1 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

尽管我不能确定我在实验中发现的现象就一定是楼主问题的解答，但是我觉得已经很接近了。
至于为什么形成二级结构的片段在琼脂糖上的泳动能力要快一些，我的猜测是：
1，和正常产物比，形成二级结构的片段分子量要小些
2，形成二级结构的片段结合的EB比正常产物要少，因而跑得快些
至于说到SSR中的双带现象，这几乎是做过的人都遇到的事情，有比较权威的解释，这里就不展开谈了。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上师兄，我问一下，有一次，我做RT-PCR时，用actin调整模板浓度，每隔3个循环拿出来检测一下，25个循环拿出来检测时有两条带，28个循环再检测时就剩一条带了，这怎么解释呢？

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这个。。。。 很难回答。
实验上遇到奇怪的现象会很多，关键是有没有重复性。
如果你每次做，都是这个结果，那么倒是可以探讨一下。
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abc816[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉部分PCR产物形成二级结构的可能性比较大。
以前提质粒的经验：提质粒的时候跑电泳，一般会出现三条带，提的好的时候，超螺旋（跑的最快的，在最前面）比较亮。中间是线性化的分子，质粒的分子量依靠这条带来判断，跑的最慢的是开环的分子。
也就是说，虽然楼主电泳有两条带，但序列可能是相同的，不知道什么原因造成有部分pcr产物二级结构的变化，从而电泳显示两条带。
期待楼主分别回收两条带，测序的结果。
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vcve[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
简单重复序列出现“影子带”的问题似乎很常见啊。我碰到问题之后看过一些关于简单重复序列出现影子带的文献，机制不是特别清楚，但“滑动”理论似乎比较受到认同。也有一些解决办法，似乎都不是很彻底。
看看这篇文献？《二核苷酸微卫星PCR扩增的影子带及其来源》

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感觉这篇文章对特异与非特异错配的异源双链的判断也没讲清楚，证据不是很足。板胶的分辨率太低，我觉得应该做做毛细管电泳看看。我分析过相当多毛细管的峰图数据，从没有见到过异源双链峰，当然，不排除毛细管里不会发生异源双链的情况的可能，但我认为原理上需要解释，并且应该做实验验证。
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vcve[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充一下，我认为楼上的混合PAGE实验对这篇文章是个很好的补充。Good job！
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dior[使用道具]
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发表于 2015-9-1 18:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是引物二聚体 或者提高退火温度试试
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