PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】PCR拖尾好严重啊 有图

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 32  1/4 1234››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】PCR拖尾好严重啊 有图

西子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74481
精华 0
积分 257
帖子 254
信誉分 100
可用分 2046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
1

发表于 2015-9-4 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR拖尾好严重啊 有图


中间的是Marker，两边分别是两种引物的温度梯度（Tm：55度、57度、59度、61度、63度）的pcr结果，拖尾现象好严重。。。。。100V，30min。前提是我酵母基因组提取的也不纯，有相近的两条带（重做还是两条带）。所以想说是不是有我模板的原因？还有其他可能的原因吗？大家踊跃发表意见啊！！


查看积分策略说明
附件
2015-9-4 11:05
10301231.jpg (16.35 KB)
 
顶部
dog002[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76386
精华 0
积分 916
帖子 1452
信誉分 100
可用分 8133
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
2

发表于 2015-9-4 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你电泳上样量是多大？还有你做PCR的时候模板的量是多大？是不是模板量太大的原因？
顶部
newway[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
3

发表于 2015-9-4 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很难可能是引物特异性不好，最好重新设计一对！还有一种可能是退火温度太低所致
顶部
vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
4

发表于 2015-9-4 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
减少循环数
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2015-9-4 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能原因：
1.酶量过多
2.退火温度偏低
3. Buffer不合适
4.dNTP、Mg 2+浓度偏高
5.循环次数过多
建议从以下几方面优化：
1.减少DNA聚合酶用量
2.适当提高退火温度
3.适当降低dNTP和镁离子的浓度
4.减少循环次数
顶部
eor[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 117906
精华 0
积分 392
帖子 484
信誉分 100
可用分 3226
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-12-7
状态 离线
6

发表于 2015-9-4 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

引物不好，如果不换引物优化PCR条件！
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
7

发表于 2015-9-4 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你电泳上样量是多大？还有你做PCR的时候模板的量是多大？是不是模板量太大的原因？

=====================================================================

pcr的时候模板量2ul，引物都是1.5ul，50ul的体系。电泳加样是20ul，maker是加了5ul。
顶部
西子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74481
精华 0
积分 257
帖子 254
信誉分 100
可用分 2046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
8

发表于 2015-9-4 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很难可能是引物特异性不好，最好重新设计一对！还有一种可能是退火温度太低所致

========================================================================================================

我已经测序了，结果好差，匹配度只有30%几 好难过。。。退火温度不低了吧。。我是用CDS两端的序列设计的引物，可变性比较小。
顶部
西子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74481
精华 0
积分 257
帖子 254
信誉分 100
可用分 2046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
9

发表于 2015-9-4 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
减少循环数

================================================================================================

减少循环数 那浓度不是偏低啊 我这是20ul的样。之前pcr30个循环，退火温度高5度，取10ul上样，条带很弱，几乎看不清。
顶部
西子[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74481
精华 0
积分 257
帖子 254
信誉分 100
可用分 2046
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
10

发表于 2015-9-4 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能原因：
1.酶量过多
2.退火温度偏低
3. Buffer不合适
4.dNTP、Mg 2+浓度偏高
5.循环次数过多
建议从以下几方面优化：
1.减少DNA聚合酶用量
2.适当提高退火温度
3.适当降低dNTP和镁离子的浓度
4.减少循环次数
......

=====================================================================================

pcr体系：
模板 2ul
上下引物 2ul
dan聚合酶 0.5ul
primer star 10ul
dNTP 4ul
ddH2O 29.5ul
pcr反应条件：
95度,5min --94度，30S --Tm：（55度、57度、59度、61度、63度），30S -----34个循环-----72度，10min
电泳条件：加样20ul，marker5ul 100V,30min
顶部
 32  1/4 1234››