【求助】谁能帮我验证下这两个引物都合格吗？

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标题:【求助】谁能帮我验证下这两个引物都合格吗？

IAM007[使用道具]
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发表于 2015-9-4 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

我的目的基因：Mus musculus peroxiredoxin 6 (Prdx6)
ncbi搜索的序列号： NM_007453.3
设计了两个，如下：
PRIMER1 引物起始位置扩增长度
F: 5`-CTGTGCCTTCGCCAGCAT 919 bp
r:5`-TGTCACCGCCCGTCTTTT 1349 bp 431 bp
PRIMER2
F: 5`-TGTGGCTCATAACCTCTT 1669 bp
R: 5`-CACCTAGAAATAAACATCCC 2004 bp 336 bp
blast了下，但是不能定夺哪个更好些？PRIMER1 我要的目的基因peroxiredoxin 6最高总得分没有PRIMER2里的高，但是PRIMER1 上下游引物的匹配比PRIMER2要好？此外有个问题就是：这两个引物的E-value值都很高，不知道有没有问题，希望战友能够帮我分析下，我选哪个引物更合理，谢谢！

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发表于 2015-9-4 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/')

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发表于 2015-9-4 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征

谢谢楼上，我把我的两对引物放进MFEprimer-2.0 Report检测了下，但是还是有点问题想向您咨询一下，希望得到您的解答和帮助。以下是我的两个引物检测出来的信息。

附件

2015-9-4 16:39

71419841.snap.jpg (25.17 KB)

IAM007[使用道具]
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发表于 2015-9-4 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我要的目的基因就是第一个NM-007453.3，图A和图B就是我的两队引物检测的信息，从图中看出，A和B的GC含量都不在引物设计原则推荐的范围内？我不知道这个问题大不大？
总图A中，可以看出我的目的基因编号1的ppc分值和编号2,编号3的ppc的分值都是100，并且正反义链的Tm值都是一样的，此外，FP△G和RP△G以及FP3'△G和RP3'△G的值也都是一样的，由此判断，若使用这对引物的话，很容易会扩增出这些非特异性的条带；
而图B中，我目的基因ppc的分值虽然是92.6，但是其他的同源序列基因的ppc、Tm值、FP△G和RP△G、FP3'△G和RP3'△G与我的目的基因的分值相差甚远，由此，我认为，这对引物比较合适。
希望wisdom_love帮我看下我的判断对吗？还有FP△G和RP△G与FP3'△G和RP3'△G，是什么意思，能说明什么问题？谢谢！

附件

2015-9-4 16:39

86987858.snap.jpg (26.6 KB)

panda王[使用道具]
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发表于 2015-9-4 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你分析的很到位，就是你这样的判断过程。
△G是引物与目标结合的自由能，3'指的是引物3‘段最后五个碱基与目标结合的自由能，FP(forward primer)和RP(reverse primer)值得是上下游引物。
不过需要提醒两点：
1. 对于A，这种情况下编号2和编号3的能对你的目的基因造成很大的干扰，但是一般情况下需要继续仔细看一下编号2和3所扩增的基因，如果是一个基因的两个变体，那么情况将不同。你的情况是，他们一个是预测的基因，另外一个是非编码RNA，预测的基因不好说，但这个非编码RNA可能会造成干扰，所以你的判断是对的。
2. 对于B，如果仅从特异性上讲，非常好，但是缺点就是GC含量偏低，造成引物的Tm值只有50°C左右，这样实际实验时你的退火温度就很低，低的退火温度容易造成意想不到的非特异扩增。
综合考虑，建议你重新设计引物，找一个特异又Tm值比较高的引物。

panda王[使用道具]
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发表于 2015-9-4 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外，引物设计可以试试下面的软件，也是我们实验室最近开发的，有任何问题欢迎随时联系。
cuturl('http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/VizPrimer/')

IAM007[使用道具]
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发表于 2015-9-4 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

之所以又拿来请教大家帮我检测下设计的这两对引物合不合理，因为自己检测时就发现这两对引物都有自己的缺点之处，都不算好，现在决定按wisdom_love提的建议，重新设计。

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发表于 2015-9-4 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外，引物设计可以试试下面的软件，也是我们实验室最近开发的，有任何问题欢迎随时联系。
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你好！请教一下看看我设计的引物怎么样？我不会分析啊！谢谢！

附件

2015-9-4 16:42

36371731.snap.jpg (37.07 KB)

vcve[使用道具]
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发表于 2015-9-4 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2015-9-4 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2015-9-4 16:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

cuturl('http://code.google.com/p/mfeprimer/wiki/HowTo')
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这个我看了！但是没看明白！请您帮我分析一下我设计的这个引物怎么样！！谢谢！！

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