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标题:【求助】血清/血浆标本中检测miRNA的内参选择

JK.jon[使用道具]
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【求助】血清/血浆标本中检测miRNA的内参选择

在做血清/血浆中miRNA的RT-qPCR时发现目标miRNA可以较好的检测到,但是根据查询后确定的内参RNU6B却没能得到较好的扩增结果,CT值都在35以上。请教有经验的研究者们如何选择血清/血浆miRNA的内参?参照芯片数据是否合适?如合适应如何选取?谢谢各位!
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whitesheep[使用道具]
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我做的是细胞和组织的,用的是u6,效果还可以,我当时选择内参主要是查文献还有在园子里请教高手,u6在细胞和组织用的比较多,血液的内参文献报道不一,U6好像用的不多,有用cel-miR-39 , miR-16,β-actin,还有用总RNA量或体积做内参的。你再查文献看看,我没有做血液,期待高手解答!
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JK.jon[使用道具]
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感谢楼上的回答,miR-16在某些报道中提示与肿瘤和溶血有关,在我们的实验中虽然没有设计这两方面,但是样品间均一性并不好;cel-miR-39是现在较多实验室的选择,但是由于国内大多使用的标本处理及提取条件方面的问题,可能会受到掺入量和保存状态的质疑;您提到的两外三种方法我没有接触过,可否给予更详尽的介绍?
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gmjghh[使用道具]
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天根的盒子用5S做内参,个人认为5S的量应该大得多,可以考虑。楼主若有结果和大家分享一下啊
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JK.jon[使用道具]
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感谢楼上的帮助,请问有5S做血清/血浆miRNA实验内参的经验或者预实验结果么?
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小明[使用道具]
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您好,我们现在也在做血浆miRNA的检测,问题和您的一样,目的miRNA 还可以,但U6 CT 值很大,请问您最后找到合适的内参了吗?可否交流一下,谢谢
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JK.jon[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 小明 于 2015-9-4 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好,我们现在也在做血浆miRNA的检测,问题和您的一样,目的miRNA 还可以,但U6 CT 值很大,请问您最后找到合适的内参了吗?可否交流一下,谢谢

你好,请问你们的样品是什么?
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QUOTE:
原帖由 JK.jon 于 2015-9-4 17:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好,请问你们的样品是什么?

血浆
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junhun[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 whitesheep 于 2015-9-4 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做的是细胞和组织的,用的是u6,效果还可以,我当时选择内参主要是查文献还有在园子里请教高手,u6在细胞和组织用的比较多,血液的内参文献报道不一,U6好像用的不多,有用cel-miR-39 , miR-16,β-actin,还有用总RNA量或体积做内参 ...

你好,你说的u6和RNU6B是一种control吗?
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dog002[使用道具]
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U6和RNU6B不是同一种control,简单来说U6的表达量相对RNU6B来说是更高的,也就是同样的条件下Ct值会更小。
to 跟帖的战友:
根据我个人的经验谈一下血液内参的问题:
1 首先应该确认一下是不是内参和目的的microrna都做了,因为如果只做了U6,发现Ct值很大的话,就下结论说这个内参不好是不太科学的,也许是你提取的RNA量或者反转录时加入的rna量就少。目前U6在血液中做内参的还是不少的。一般Ct能够在20-25之间。提示:由于U6的序列长度大于200,所以在提取时看一下试剂盒说明,例如,如果说试剂盒说明书中提到采用这种方法提取只能提取到nt小于200的片段,那实验就白做了。
2 mir-21,mir-16,mir-126也有人用来做血液mirna选为内参的
3 本来内参就是根据自己的实验才能确定的,没有千篇一律的内参。只能说U6大家使用做内参的概率比较大,但并不一定真的适合你的实验。
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