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标题:【求助】怎样做到PCR的热启动！

tie8[使用道具]
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发表于 2015-9-4 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎样做到PCR的热启动！


手动热启动法：
通常是先加模板DNA，再加入冰上预冷的Buffer、MgCl2、dNTP和ddH2O，接着将正反引物加到PCR管壁上（不使引物沉到管底），打开PCR仪，预热到80度，再加Taq酶到PCR管壁上，10000rpm甩5秒，立即放如预热的PCR仪上，开始循环。
热启动技术有很多产品，如（1）Taq酶在蜡块中，加热到94度，蜡块溶解Taq酶进入反应系统（2）Taq酶-Taq酶单抗复合物，94度10分钟灭活Taq酶单抗，使Taq酶发挥作用。可是以上的产品均较贵，反正我用不起。而又要防止非特异性产物。
根据Invtrogen手册的一张图谱，手动热启动法的效果与Platinum Taq酶（有单抗）相当。
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8964357[使用道具]
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发表于 2015-9-4 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没作过，供参考
先加好除Taq外的组分，混匀，常规加覆液体石蜡；在PCR仪或水浴中加热至80℃，然后再加酶按部就班的进行。
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发表于 2015-9-4 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=24782&h=1#115207')
前不久刚讲过，供参考。Big Smile
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xyw5[使用道具]
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发表于 2015-9-4 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

i thind the product of PCR is little short may be better than too long. it is better between 200-500 bp.
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发表于 2015-9-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xyw5 于 2015-9-4 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

i thind the product of PCR is little short may be better than too long. it is better between 200-500 bp.

但是也要考虑到跑胶照相的问题，
200bp左右的带边缘就发虚了，
而且条带亮度是和条带大小成正比的，
同样背景下，大条带比较亮。
所以我的经验是500-1000bp
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发表于 2015-9-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做热启动都是先不加酶，在95度变性后设一个72度无限期的步骤。打开PCR仪盖，逐个加酶，然后开始循环。
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发表于 2015-9-4 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 33号 于 2015-9-4 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做热启动都是先不加酶，在95度变性后设一个72度无限期的步骤。打开PCR仪盖，逐个加酶，然后开始循环。

要做96孔板PCR还不累死了。
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发表于 2015-9-4 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的样品不多。
先加酶再升温不是严格的热启动，除非使用抗体说石蜡封闭的taq。
抗体或石蜡封闭的taq就是解决了高通量的问题。
我是做基因克隆，通量不大，但酶都是高保真的。
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发表于 2015-9-4 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的方法与之差不多。一般PCR都有一个5分钟的变性期，在变性将近结束时，使PCR仪pause，加入taq酶。然后go on。。。。
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发表于 2015-9-4 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的样品不多。
先加酶再升温不是严格的热启动，除非使用抗体说石蜡封闭的taq。
抗体或石蜡封闭的taq就是解决了高通量的问题。
我是做基因克隆，通量不大，但酶都是高保真的。
......

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这也许是临床出身和基础出身的差别吧。
我们总是有结果就可以了，不够严格，
以后还须多多学习，呵呵……
各说各的理，相互多交流吧。
关键看疗效！！！
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