【求助】怎样提高目标蛋白吸附到DEAE-Sephrose Fast Flow介质的量

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标题:【求助】怎样提高目标蛋白吸附到DEAE-Sephrose Fast Flow介质的量

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发表于 2015-9-8 10:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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各位做蛋白纯化的高手好，我现在在纯化人血浆中的一种蛋白，分子量52kDa，等电点4.55，前处理采用还原剂打断杂蛋白的二硫键（不影响目标蛋白），气相二氧化硅吸附脂蛋白。
上柱子前的蛋白含量为7mg/ml，平衡液为50mM pH 7.5的Tris，在平衡液中增加NaCl盐浓度0.05M、0.1M、0.15M、0.2M梯度洗脱，通过活性测定和SDS-PAGE电泳发现0.05NaCl洗脱杂蛋白，0.1MNaCl洗脱目标蛋白。
存在的问题是未结合在介质上峰很大，里面也有不少目标蛋白，活性比0.1MNaCl洗脱峰的活性还高。
我已经尝试提高平衡液的pH到8.0，其余都不变，效果还不如原来，未结合峰的活性更大。该怎样改变条件才能提高目标蛋白在介质上的结合量呢？求各位前辈指点迷津，感激不尽。
以下是我的AKTA层析图谱，第一个是pH 7.5，第二个是pH8.0

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2015-9-8 10:58

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发表于 2015-9-8 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这五个峰分别是未结合（峰很高）、0.05M、0.1M、0.15M、0.2MNaCl洗脱

这五个峰分别是未结合（峰很高）、0.05M、0.1M、0.15M、0.2MNaCl洗脱，后面是机器不稳定造成的峰

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2015-9-8 10:59

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ROSE李[使用道具]
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发表于 2015-9-8 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先介质本有自己性能，即自身的动态载量，这个载量会随着样品的性质发生改变，也会随流速改变。有较大的穿透，证明在该条件下已达到你的动态载量。
我个人介意从以下几个方面入手：1、降低平衡液电导与样品电导。之前你用还原剂，样品中电导值必然会比较高。通过稀释降低电导值。2、提高上样pH,你也尝试了，可以进一步探索，在保证蛋白性质不改变情况下。3、降低流速，高流速下，结合性能下降。3、更换介质，DEAE属于弱阴离子交换，可以换成强阴离子试试。你的基架，琼脂糖的，可以换成其他种类，推荐你可以试试 ABI的POROS Q

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发表于 2015-9-8 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ROSE李 于 2015-9-8 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先介质本有自己性能，即自身的动态载量，这个载量会随着样品的性质发生改变，也会随流速改变。有较大的穿透，证明在该条件下已达到你的动态载量。
我个人介意从以下几个方面入手：1、降低平衡液电导与样品电导。之前你用还原 ...

根据你提的几点建议我是这样想的：1.我没测过前处理上样前样品的电导率，也没透析，因为是预实验，就想大致看一下，最好是样品能处于平衡液那种状态下，吸附最准了，下次在做时决定透析一下，置换溶解蛋白的溶液为平衡液。2.提高平衡液的pH，我以前用试管法（介质装在试管中，不断用平衡液洗涤平衡，吸取上清液，再加平衡液洗涤，最后加杨平，测上清液的活性和蛋白含量）试过目标蛋白在pH7.0,7.5,8.0,8.5条件下，哪个吸附效果最高，结果是随着pH值的升高，上清液的活性也升高，说明目标蛋白没吸附上，pH7.0,7.5吸附情况差不多，这次用AKTA试果然pH 8.0效果不如7.5，所以要不要降低pH，换Tris为PBS？3.我的流速是2ml/min，上样和洗脱都是这个速度，还要降低吗？4.文献中都用的DEAE这个胶，或者是比较几种胶的效果，发现还是DEAE弱阴离子胶好一点。
啰嗦了这么多就是不知道下一步该怎么办，实验卡住了，希望找个师兄师姐好好讨论一下，再次感谢你

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发表于 2015-9-8 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、透析或者用超滤离心管换液至平衡缓冲液，可以有效降低样品电导值。2、既然pH你已经做过实验了，影响不大，那平衡液的电导值呢？ 50mM的浓度你是怎么得来了，一般都会产用20mM作为起始离子强度，若结合效果好，可再进一步优化。既然你为了保证不穿透，可以尝试降低你的平衡液浓度，10mM 20mM均可。3、流速，你给我的是体积流速，你柱子是多少尺寸的，你可以自己换算下，推荐线性流速100cm/h时，看有木有增加你的结合量。4、缓冲液阴离子一般就用Tris 其PK大概在8.0左右，缓冲效果好，无需更换成PB

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发表于 2015-9-8 11:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ROSE李 于 2015-9-8 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、透析或者用超滤离心管换液至平衡缓冲液，可以有效降低样品电导值。2、既然pH你已经做过实验了，影响不大，那平衡液的电导值呢？ 50mM的浓度你是怎么得来了，一般都会产用20mM作为起始离子强度，若结合效果好，可再进一步优化。 ...

1.周三做过一次用超滤离心管换平衡液的实验，超滤后35ml体积变成30ml，蛋白含量由4mg/ml降低到2mg/ml，不过比活没有下降太多，证明可行。不过这次的平衡液我用了0.05M pH 6.5的PS，AKTA层析图的未结合峰降低了很多，还以为改变条件结合上去了，但测活的结果显示未结合峰依然活性很高。2.起始缓冲液的浓度是看纯化该蛋白的专利得到的，它有个范围，我就选了一个中间的浓度，感觉20或者10mM是不是太低了，这样缓冲液的缓冲能力比较小，体系不够稳定，50mMTris的离子强度是2.2左右，周三PS的离子强度为4.2。3.我用的是GE的小柱子，直径1.6cm，这几次次我都装15ml胶左右，它的载量大约110mg/ml，算了一下，线性流速为60cm/h。4.换了缓冲溶液效果并不好，今天的实验改用Tris在做一次。
出峰分别为未结合、0.05MNaCl、0.1MNaCl、0.5MNaCl 纵坐标是电导率，截图时忘了换成UV

0.5MNaCl洗出两个峰，可能是盐浓度一下子增加太多引起的
这是样品的实验数据

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2015-9-8 11:01

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图谱的值下降，源于你样品浓度低了。50mMTris的离子强度是2.2左右，周三PS（你用的是PB还是PBS ？）的离子强度为4.2，相通浓度的，PB的离子数更多，虽然只差2.2，但对离子交换的影响是巨大的额，我之前仅差0.5单位，样品回收率就差很多。50mMTris的离子强度不大，与20mMpb相当，不需要换。
关于缓冲能力，浓度越低，缓冲能力下降，但是由于你样品也在平衡液体系中，期间不会有过强酸碱引入，不会造成pH波动的，我们这所有的平衡液体系都是20mM，我看技术手册也都是20mM的体系，升高平衡液pH有可能使结合不牢的杂蛋白去除，当然也会使目的蛋白结合力下降。介质载量110mg/ml，是理论的，特定的条件的，实际远远低于，但是你用15ml的柱子，，应该也不会超过它载量的，。。。很奇怪。。请问用完之后有CIP么？

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小中大

不知楼主的纯化目标是什么？
是只想得到较纯的目的蛋白做分析呢？纯度有何要求？
还是需要优化工艺提高收率和分辨率？
如果是后者，选择一个合适的填料是首要的，主要考察其结合能力、分辨率，可尝试一下强阴的Q；其次是筛选一个合适的上样条件，离子交换也就是筛选合适的上样pH，阴离子结合洗脱模式一般高于等电点0.5个pH以上，当然要注意上样时电导率低一些（一般<5 mS/cm）；在填料和上样条件确定的情况下，就要去测你目的蛋白的动态结合载量（DBC），这样，你才能确定你的上样量，避免流穿；洗脱可用线性梯度洗脱来提高分辨率和收率，再由线性洗脱条件转化为阶梯洗脱，以节约时间和Buffer。
根据你的情况，建议降低上样量，看是否还会有流穿，用盐浓度线性梯度洗脱，0-20%B （1 M NaCl），20 CV，分管收集看主要成分在哪里。

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原帖由 ROSE李 于 2015-9-8 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

图谱的值下降，源于你样品浓度低了。50mMTris的离子强度是2.2左右，周三PS（你用的是PB还是PBS ？）的离子强度为4.2，相通浓度的，PB的离子数更多，虽然只差2.2，但对离子交换的影响是巨大的额，我之前仅差0.5单位，样品回收率就差很多。5 ...

介质用完用1MNaOH洗，再换2MNaCl，再换20%乙醇，用的是说明书里的再生方法，没用用在位清洗。
周五做的实验还是原来的条件pH 7.5Tris平衡，0.05MNaCl洗脱杂蛋白，0.1MNaCl洗目标蛋白，只在上样之前增加了超滤管超滤，目标蛋白就结合上去了，AKTA图谱上0.1MNaCl峰达到1400mAU，未结合不到400mAU，测活是光看颜色就知道目标蛋白结合上去并被洗脱下来了，这次的结果出乎意料，很理想，原来只是要增加一步超滤就可以解决问题啊，我又重复了一次，没周五的结果好，但基本上重复出来了，非常感谢cpu随风而逝提的建议，作出结果我就回家休息了一段时间，刚回来进行第二步精制纯化，再次感谢。

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发表于 2015-9-8 11:03 资料个人空间短消息加为好友

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原帖由 ssonglikihi 于 2015-9-8 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知楼主的纯化目标是什么？
是只想得到较纯的目的蛋白做分析呢？纯度有何要求？
还是需要优化工艺提高收率和分辨率？
如果是后者，选择一个合适的填料是首要的，主要考察其结合能力、分辨率，可尝试一下强阴的Q；其次是筛选一个合适 ...

我的课题就是把目标蛋白纯化出来，纯度要达到95%，对蛋白进行鉴定。
填料是组长定的，刚到实验室对胶也不熟悉，现在恶补了一点专业知识才好一点。
在上样前增加一步超滤，目标蛋白已经可以结合上去了，平衡液为pH 7.5的tris，离子强度2.2，满足低电导率的要求。
我是初步摸索15ml胶，20ml样品，浓度为3mg/ml，上样量是比较小的，这样做的快，利于分析。
不过最终还是要放大，你提到的动态结合量相信对我有很大的帮助，现在还不知道怎么测，不过我会好好学习一下，确定上样量，不懂的地方再来请教你