求助PCR引物情况 - 经验共享

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标题:求助PCR引物情况

#甜#[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另外酶是MBI的，5u/ul

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

毛病不会在引物的特异性吧？这个我可没办法估计，你再查查。

还有，是不是误差太大？

昨天有一个师兄做25ul体系无果，做50ul体系就做出来了。

想来毛病应该在误差上。

MBI ? 我没用过，立陶宛的公司？是不是还不如上海Promega了？我不知道，不过内参扩出来就应该问题不大。

冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是#甜#所说的朋友，非常感谢你的指点。因我后续实验要做荧光PCR，因此杂带的出现非常不利。我今下午把延伸时间减为0sec，即温度两点法，去除了其中一条杂带，目的基因明显变亮，但另一条杂带仍无法去除，目前我决定换引物。另一对引物也想请您指点：引物序列为：
sense:5'caa ccc tgg tta tcg tct cat tg3'
antisense:5'agg cta acg gag atg cac att g3'

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下游引物和目的基因没有同源性
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html')

冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常抱歉，刚刚引物反义链输入错误。正确为：
sense:5'caa ccc tgg tta tcg tct cat tg3'
antisense:5'cgt tcc ctt ctg tgt ctt ctt cc3'。另基因库序列文档太大，若您愿意帮忙的话，可在网上下载。号码为：NW_043767. Rattus norvegicus
912621 bp DNA
非常非常感谢您的指点，还想麻烦您继续指导。

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

分析结果如下：我觉得设计挺好，虽有不足这回是引物二聚体倾向稍大，但不应该影响大局。通过提高退火温度应该能解决。
１。一般情况：
--------------------------------------------------------------------------------
Selected Primers
--------------------------------------------------------------------------------
NewSequence1:1596U23 Upper Primer
5' CAA CCC TGG TTA TCG TCT CAT TG 3'
Length: 23-mer
5' 1596
Tm: 68.5 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.1 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 413/413
1/E: 4.78 nmol/A260
33.7 µg/A260
NewSequence1:1727L23 Lower Primer
5' CGT TCC CTT CTG TGT CTT CTT CC 3'
Length: 23-mer
3' 1727
Tm: 69.3 °C (salt 1000.0 mM; oligo 100.0 pM)
deltaG (25 °C): -42.6 kcal/mol
Degeneracy: 1
P.E.#: 421/421
1/E: 5.35 nmol/A260
37.2 µg/A260

２。3'二聚体
uper : - 3.8 lower: X uper/loer: X

3. 3'发夹结构：
uper: X lower: X

4: PCR:

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

--------------------------------------------------------------------------------
PCR
--------------------------------------------------------------------------------
Optimal Annealing Temperature: 55.9° (Max: 72.0°)
--------------------------------------------------------------------
Position Length Tm [°C] GC [%] P.E.#
--------------------------------------------------------------------
Product ----- 154 85.1 51.3 51.3
Upper Primer 1596 23 71.2 47.8 413/413
Lower Primer 1727 23 71.9 52.2 421/421
--------------------------------------------------------------------
Product Tm - Upper Primer Tm: 14.0
Primers Tm difference: 0.7
----------------------------------
Concentration
----------------------------------
Upper Primer 200.0 nM
Lower Primer 200.0 nM
Monovalent Cation 50.0 mM
Free Mg[2+] 0.7 mM
----------------------------------
Total Na[+] Equivalent: 155.8
5.内部稳定性

附件

2011-9-15 12:36

114180-soina-embed.jpg (52.46 KB)

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果引物还没有定，建议
上游引物向5'端前进两个碱基，改为：
ACCAACCCTGGTTATCGTCTCAT
下游引物向3'端前进一个碱基，改为：
GCGTTCCCTTCTGTGTCTTCTTC

此时上游引物二聚体倾向则为－1.5，比-3.8好很多了
其余参数没有大的变动。

PCR产物改为157bp ,退火56C
如果用PE9600或以上的机器,以及薄壁小管，
延伸温度改为0sec没有问题。

此时的内部稳定性就好多了你看是不是：

附件

2011-9-15 12:36

114186-soina-embed.jpg (49.2 KB)

冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常非常您的指点,我试试.您对这些东西顺手拈来这么熟悉,功夫真不浅哪.

韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-15 12:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，不要客气，
通过我们的努力能使更多的人学会一些东东是最好的了。。

这几天我在这里光围着引物转呢，
也做了很多范例，

相信有心人能学到不少东西，
也希望被帮的人能及时反馈，

那怕我的建议no work，
我也需要反馈，这样才能改进。

呵呵～～～～～～～～～～～～～

祝你好运～～～～～～～～～～～～～～～

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